莲是我国重要的水生蔬菜,具有很大的经济和观赏价值。目前人们已经从莲的形态学、分类学、生理学、药物学等方面进行了广泛的研究。随着功能基因组学的迅猛发展,克隆和鉴定各种抗性、品质基因,利用基因工程技术培育高产优质和耐胁迫的新品种,已成为未来解决农业生产问题的重要技术。作为一种重要的经济作物,莲的分子生物学研究却相对比较匮乏。本文通过构建莲cDNA文库,克隆了与莲在胁迫环境下发挥重要作用的一些基因,并对其功能进行了初步的分析,为莲的转基因研究和应用提供了一些分子证据。1莲cDNA文库的构建为发掘各种影响莲抗性、品质和具有调控作用的功能基因,我们采用SMART技术成功构建了藕莲和花莲顶芽的cDNA文库。花莲原始cDNA文库滴度达到4.2×106pfu/mL,重组率为100%,97%的文库插入片断在0.5kb以上,扩增文库的总容量达到8.5×108pfu/mL,保障了高比例全长cDNA的获得。通过已知的NnUBC3基因对花莲文库进行筛选验证,成功得到约586bp的全长目的基因,其基因编码区域为459bp,3’UTR序列为127bp。这些数据表明,我们构建的花莲顶芽cDNA文库的有效性,适合以后的测序和基因功能研究。2NnGPX1的克隆及在胁迫环境中的功能分析GPX是一种抗氧化酶,能催化H202或者过氧化氢物形成水或者乙醇,使机体免受氧化损伤。我们在莲中克隆了NnGPX1的全长cDNA,通过对莲进行不同Na2Se03浓度处理发现,NnGPX1与大多数植物GPX一样,是一个不依赖硒的GPX蛋白。不同发育时期的组织表达分析发现,NnGPX1在幼苗时期的叶和开花时期的顶芽中表达水平最高,在成熟的胚芽中也有一定的表达。植物GPX家族的成员分别在不同的胁迫环境中发挥作用。我们对莲进行冷、热、机械损伤、高盐、ABA、PEG等不同时间梯度的胁迫处理,发现NnGPX1表达水平在各种处理后都迅速升高,这与其它植物GPX不同,说明NnGPX1在莲生长发育和面对胁迫环境时起着重要的调节作用。同时我们对NnGPX1进行了表达,纯化和蛋白质结构的预测,有待进行更进一步的功能分析。3莲泛素转运酶NnUBC的克隆与功能分析E2(UBC)是真核生物泛素化必需的酶之一,与E1,E3共同催化底物蛋白的泛素化。组蛋白H2B单泛素化影响着开花基因的转录与表达,同时泛素化在植物应对胁迫环境时也发挥着重要作用。我们克隆了莲的4个NnUBC全长cDNA,荧光定量PCR的结果显示这4个基因在莲不同组织中有着不同的表达模式,其中NnUBC3在植株的各个组织中表达量最高。于是我们进一步获得了NnUBC3的全长基因组DNA,并通过NnUBC3全长CDS对拟南芥ubcl,2双突变体进行转化,使突变体表型得以恢复。NnUBC3的亚细胞定位结果与拟南芥UBC一致,分布于细胞质和细胞核内,证明NnUBC是泛素转运酶。在对莲进行了不同的处理后发现,NnUBC3在NaCl, ABA, PEG胁迫中发挥着重要的调控的作用。4VvPYL在ABA信号通路中的功能分析ABA是植物应对生物和非生物胁迫的重要调节因子,特别是干旱和高盐环境下,通过调控ABA应答基因表达来控制植物生长。我们克隆了3个葡萄的VvPYL,氨基酸序列比对和聚类分析结果显示与拟南芥PYL家族有很高的同源性。对VvPYL进行组织特异性表达分析发现,VvPYL1在叶,茎和根中的表达量都比较高,且在ABA处理后表达水平上调。ITC实验结果表明,在体外VvPYL1能与ABA结合,解离常数为78uM。磷酸酶活性测试结果显示,VvPYL1在ABA存在时,几乎完全抑制拟南芥ABI1的磷酸酶活性。通过对小烟草的转化发现,VvPYL1亚细胞定位于细胞质和细胞核中,结果与拟南芥PYL的定位一致。所有结果证明VvPYL1是ABA的受体,这也是关于葡萄ABA受体研究的首次报道。