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水貂阿留申病(Aleutian disease of mink, AD)是由水貂阿留申病毒(Aleutian mink disease virus, AMDV)感染而引起的重要疫病。该病以浆细胞弥漫性增生和慢性持续性感染为主要特点,常可导致免疫系统紊乱,母貂产仔数减少,仔貂大量死亡,给养貂业造成了极大的危害。由于AMDV基因组的3’-端和5’-端分别存在Y-型和U-型结构,给全基因组序列测定造成一定的困难。目前,仅AMDV弱毒株ADV-G完成了全基因组测序,而野病毒株序列均为基因组中间部分。另外,弱毒株ADV-G能够在克兰德尔猫肾细胞系(Crandell feline kidney cells, CRFK)细胞系中连续培养,而野病毒株均无法在体外持续传代。上述特点使阐明ADV-G与野毒株基因组间的差异无法进行,更无法阐明其分子致病机理,给该病的病原学、免疫学研究造成了严重的阻碍。本研究首先设计AMDV基因组末端特殊克隆方法,成功完成了一野毒株BJ的全基因测序(GenBank KT329428)。通过BJ与ADV-G的各部分基因的同源比对,预测可能影响病毒体外复制和致病力的功能基序。以成功构建的ADV-G感染性克隆为基础,在其主要结构蛋白VP2中引入系列突变,通过检测突变体克隆在CRFK细胞中生长水平的差异,定位影响ADV-G体外增殖的功能残基。进而将ADV-G中的个别氨基酸残基或部分片段替换成BJ中的对应氨基酸残基或部分片段,构建出嵌合体感染性克隆。成功实现体外拯救的感染性克隆对水貂的感染,为AMDV致病机理的研究奠定了坚实基础。主要研究结果和结论如下：(1)通过设计特殊末端重复序列(Inverted terminal repeat, ITR)克隆方法,完成了一野毒株BJ的全基因组测序。经序列比对分析发现,BJ的结构蛋白2(Viral protein 2, VP2)基因中存在所有高致病毒株保守的氨基酸残基,证实BJ为高致病毒株。通过与ADV-G进行同源比较,发现两毒株5’U型ITR结构存在明显差异。并证实AMDV毒株非结构蛋白3 (Non-structural protein 3,NS3)开放阅读框终止密码子的位置并不固定,这个现象在其它细小病毒中十分罕见。(2)参照BJ和ADV-G的同源比对结果,选择人工合成非结构蛋白1 (Non-structural protein 1, NS1)a.a.36-52和VP2 a.a.428-446两个保守的亲水肽段,免疫小鼠制备单克隆抗体,成功筛选数个杂交瘤细胞株,产生的细胞培养上清液经检测与拯救毒株rADV-G反应灵敏且特异,可用于拯救病毒的检测。(3)参照NCBI上公布的ADV-G全序列,人工合成基因组3’和5’端难以克隆的区域,再利用PCR克隆中间非发夹序列,利用In-Fusion技术将各片段连接起来,构建成ADV-G全长基因组克隆质粒pADV-G,并对基因组进行无义突变(A3875C)引入Sac I酶切位点作为遗传标记。将pADV-G转入CRFK细胞,连续传代,从基因组复制、转录和翻译水平证明成功拯救病毒rADV-G,对盲传13代rADV-G的cDNA进行遗传标记检测,证实rADV-G能够在CRFK细胞中稳定遗传。(4)利用从国内不同地区分离鉴定的AMDV毒株(BJ, SD, HLJ和HB)基因序列与其他国内外报道的17株AMDV序列进行同源比对,发现野毒株与ADV-G在VP2上存在4个保守的氨基酸位点差异,即92、94、115和116位。在pADV-G引入上述突变,通过突变体克隆在细胞中转录和翻译水平的检测,证实位于VP2衣壳表面三重对称轴附近的92H和94Q氨基酸残基对于ADV-G在CRFK细胞中的持续增殖起着决定性作用。(5)将BJ高致病毒株编码VP2 455-590位氨基酸区段的核苷酸序列替换pADV-G感染性克隆中的对应序列,再引入VP2 I352V氨基酸突变,构建出两个嵌合体全基因克隆,并成功拯救出病毒。水貂接种实验证明,嵌合体病毒能够感染水貂,在接种10天后产生短暂的病毒血症,接种30天仍能检测到抗AMDV的抗体,但组织切片显示未产生典型的AD。以上结果从全病毒的角度定位了AMDV衣壳蛋白VP2上存在的决定ADV-G体外复制能力的关键功能残基,并且通过构建嵌合体病毒的方式证明了ADV-G VP2部分基序的改变可以使病毒获得感染水貂的能力。同时在全基因水平比较野毒株BJ同ADV-G间的差异,为AMDV致病性的研究提供了新的方向。