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研究背景视网膜母细胞瘤(retinoblastoma,RB)是儿童眼内最常见的恶性肿瘤,好发于5岁以下婴幼儿,新生儿发病率为1∶16 000～18 000。在我国,每年约有1100名新发病儿童。RB患儿最常见的临床症状是白瞳、斜视,早期常无自觉症状而就诊延迟,我国大多数患儿就诊时肿瘤已发展到D期、E期甚至眼外期,错过了最佳治疗时机,给患儿及其家庭造成了巨大的伤害,对社会产生了巨大的经济负担。目前认为视网膜母细胞瘤的发生与Rb1等位基因的二次突变有关,但研究发现Rb1基因的失活只是导致视网膜母细胞瘤发生发展的冰山一角,越来越多的证据表明其他基因(如MYCN癌基因突变)以及表观遗传学的改变----非编码RNA,为RB的发生发展所必需。MicroRNAs(miRNAs)是一组内源性、非编码短链RNA,通过与靶基因mRNA的3’UTR相互作用,抑制靶基因的翻译,在人类肿瘤的发生发展中发挥类似原癌基因或抑癌基因的作用。已经发现miRNA在多种肿瘤诊断中具有较高的敏感性和特异性,在研究视网膜母细胞瘤分子机制中具有重要意义。我们采用基因芯片筛选技术动态观察RB患者在静脉VEC方案化疗前、化疗1个疗程及化疗3个疗程后血清中miRNA的变化情况,发现miR-4516在治疗后表达下调,提示miR-4516可能与RB的发生发展有关。研究发现miR-4516在甲状腺乳头状癌、小细胞肺癌、肝癌、前列腺癌和急性髓系白血病中表达异常,在恶性胶质瘤患者中miR-4516代表负向预后因子,通过调控PTPN14/Hippo通路起类似致癌基因的作用,miR-4516可能成为恶性胶质瘤治疗的一个新的潜在治疗靶点。研究表明miR-4516与肿瘤的发生发展存在密切联系,但目前关于miR-4516在RB中的作用尚未见报道。研究目的:本研究拟通过肿瘤组织及细胞进行相关的基础实验,探讨miR-4516对视网膜母细胞瘤生长的影响及作用机制。基础实验第一部分研究miR-4516在视网膜母细胞瘤组织及Y79细胞中的表达,观察miR-4516对Y79细胞增殖及凋亡的影响;第二部分通过生物信息学软件预测miR-4516的靶基因,并验证其与靶基因的结合情况;第三部分重点探讨miR-4516对靶基因的调控作用,以及对其下游信号通路的影响。研究方法:1、qRT-PCR检测miR-4516在RB肿瘤组织和RB细胞(Y79)中的表达。2、CCK-8细胞增殖实验、流式细胞术、Hoechst细胞染色实验检测miR-4516对Y79细胞生长活性及凋亡的影响,Western blot检测miR-4516对Y79细胞中凋亡相关蛋白P53及Bcl2表达的影响。3、Targetscan、miRWalk、miRanda生物信息学方法预测miR-4516的下游潜在靶基因,并用双荧光素酶报告基因实验验证miR-4516与下游靶基因的结合情况。4、qRT-PCR及Western blot检测miR-4516对Y79细胞PTEN基因mRNA及蛋白表达的影响。5、CCK-8细胞增殖实验、流式细胞术及Hoechst细胞染色检测miR-4516通过靶基因PTEN对Y79细胞增殖及凋亡的影响。6、Western blot检测Y79细胞中miR-4516对PTEN/AKT信号通路中关键蛋白表达的影响:PTEN、AKT、pAKT、MDM2、P53、Bcl2。结果:1、miR-4516在RB肿瘤组织中的表达水平高于正常视网膜组织(P<0.05);miR-4516在Y79细胞中表达水平高于正常对照(P<0.01)。2、抑制miR-4516,Y79细胞生长受抑制,细胞凋亡增加,P53蛋白表达增加,Bcl2蛋白表达减少;过表达miR-4516促进Y79细胞的生长,细胞凋亡减少,P53蛋白表达减少,Bcl2蛋白表达增加。3、生物信息学预测PTEN是miR-4516潜在下游靶基因,双荧光素酶报告基因实验证实miR-4516与PTEN mRNA的3’UTR(第908到915碱基)互补配对结合。4、miR-4516 mimics转染Y79细胞后,PTEN基因mRNA及蛋白的表达受抑制。5、miR-4516 inhibitor+si-PTEN共转染可以逆转miR-4516 inhibitor对Y79细胞增殖的抑制作用,miR-4516 mimics+pcDNA-PTEN共转染可以逆转miR-4516 mimics对Y79细胞增殖的促进作用。6、miR-4516 inhibitor+si-PTEN共转染可以逆转miR-4516 inhibitor对Y79细胞凋亡的促进作用,miR-4516 mimics+pcDNA-PTEN共转染可以逆转miR-4516 mimics对Y79细胞凋亡的抑制作用。7、转染miR-4516 mimics后,Y79细胞PTEN蛋白和P53蛋白表达减少,AKT蛋白、pAKT蛋白、MDM2蛋白、Bcl2蛋白表达增加;共转染miR-4516 mimics+pcDNA-PTEN可以逆转miR-4516 mimics对Y79细胞PTEN/AKT信号通路相关蛋白的表达。8、转染miR-4516 inhibitor后,Y79细胞PTEN蛋白和P53蛋白表达增加,AKT蛋白、pAKT蛋白、MDM2蛋白、Bcl2蛋白表达减少;共转染miR-4516 inhibitor+si-PTEN可以逆转miR-4516 inhibitor对Y79细胞PTEN/AKT信号通路相关蛋白的表达。结论:1.miR-4516在视网膜母细胞瘤肿瘤组织和Y79细胞中高表达;2.miR-4516促进Y79细胞的增殖,抑制细胞凋亡;3.miR-4516的靶基因是PTEN;4.miR-4516通过调控PTEN/AKT信号通路发挥类似致癌基因的作用,抑制Y79细胞的凋亡,促进视网膜母细胞瘤的生长。