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结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)是第二大致死性感染性疾病的病原体,以呼吸道感染为主要途径,一旦入侵宿主体内即很难被清除,并且由于缺乏准确、快速和有效的诊断手段及安全、有效的预防性疫苗,此病的防治仍然是我国需要解决的重大问题之一。据估计,世界人口三分之一有MTB的潜伏感染,5%~10%的感染者在今后的生命中将发展成活动性结核病,因此,对结核潜伏感染(latent tuberculosis infection,LTBI)进行有效防治至关重要。目前卡介苗(M.bovis Bacillus Calmette-Guérin,BCG)是预防TB的主要疫苗,但其免疫效果并不十分确定,并不能有效地预防LTBI发展为TB,因此针对潜伏感染的疫苗的开发对于TB的控制具有重要的意义。潜伏相关抗原在MTB潜伏感染期上调表达,有可能成为潜伏感染的标志物及针对潜伏感染者的潜伏感染疫苗。本研究应用生物信息学软件分析MTB Rv3287c蛋白的抗原表位,了解其抗原性;应用分子克隆技术制备了Rv3287c重组蛋白,并研究其免疫原性。一、MTB Rv3287c蛋白抗原的表位预测、蛋白相关分析及其优化:利用DNAStar软件包中Protean软件对Rv3287c氨基酸序列进行分析,采用包括二级结构、亲水性、抗原性、可及性、柔韧性、电荷分布等多参数预测其二级结构及T细胞和B细胞抗原表位。利用SYFPEITHI超基序法、BIMAS量化基序法和Net CTL在线远程预测CTL表位。Rv3287c具有丰富的二级结构,含有较少潜在的B细胞抗原表位,主要位于1~20、78~88、112~130、137~145氨基酸残基或其附近,这些区域基本上含有β转角结构,抗原性、亲水性、表面可能性和柔韧性指数都较高;含有较多潜在的T细胞表位,主要位于16~19、24~25、28~44、47~52、54~68、71~79、84~88、91~101、107~109、111~124、126~129、140~143氨基酸残基或其附近。利用SYFPEITHI超基序法、BIMAS量化基序法和Net CTL在线远程预测CTL表位,SYFPEITHI的预测结果显示Rv3287c蛋白抗原在HLA-A*0201、HLA-A*03和HLA-B7评分在18分以上分别有22个、19个和4个。BIMAS的预测结果显示其在HLA-A*0201、HLA-A*03和HLA-B7评分在30分以上分别有4个、0个和3个。Net CTL的预测结果显示其在HLA-A*0201、HLA-A*03和HLA-B7评分在0.75分以上分别有6个、1个和7个。根据大肠杆菌偏爱的密码子对rv3287c碱基序列进行优化。使用TMHMM软件对蛋白进行跨膜预测,使用Signal P软件2.0版进行信号肽分析,发现Rv3287c蛋白是一个无信号肽、不分泌的胞浆蛋白。二、MTB Rv3287c克隆、表达、纯化:通过基因合成含puc57-rv3287c重组质粒的大肠杆菌基因工程菌,再用高纯度质粒小提试剂盒提取质粒puc57-rv3287c,经NheⅠ和Eco RⅠ双酶切进行鉴定后,再大量回收rv3287c基因片段,与同样经NheⅠ和Eco RⅠ双酶切的载体p ET30a在T4 DNA连接酶的作用下连接,连接产物转化至大肠杆菌BL21感受态细胞,涂板、挑选单克隆进行酶切鉴定及测序鉴定,鉴定正确后提取质粒,将该原核表达质粒命名为p ET30a-rv3287c。用IPTG诱导蛋白表达后,用固化镍吸收色谱纯化蛋白。结果显示重组质粒p ET30a-rv3287c构建成功,测序结果正确。蛋白在大肠杆菌中以包涵体形式表达,蛋白分子量约14.89k Da,纯化得到目的蛋白。三、MTB Rv3287c重组蛋白免疫学特性的研究以增殖期蛋白(CFP10-ESAT6)为对照,建立以重组潜伏感染相关蛋白Rv3287c为抗原的ELISPOT方法,选取健康对照组128例、结核潜伏感染者63例、活动性肺结核病患者55例及非结核呼吸疾病患者48例四类人群,检测分泌IFN-γ的效应T细胞斑点数(SFCs),比较其在不同人群中的差异,评价它们在抗结核潜伏感染细胞免疫应答中的作用。通过ELISA方法检测其在健康对照组30例、结核潜伏感染组35例、活动性结核病组30例及非结核呼吸病组30例人群血清中特异的抗Rv3287c蛋白的抗体Ig G水平,并比较组间差异,了解其体液免疫反应状况。以潜伏感染组效应T细胞SFCs为阳性组,以活动性结核病组SFCs为阴性组,绘制该潜伏相关抗原鉴别结核活动性感染与潜伏感染的ROC曲线,在特异度80%及90%两个点取SFC的cut-off值,以此评价并且比较潜伏感染蛋白对结核活动性感染与潜伏感染的鉴别诊断效能。结果显示:Rv3287c蛋白潜伏感染组的SFCs值高于健康对照组,但差异不明显(p>0.05),而潜伏感染组的SFCs值显著高于活动性结核病组(p<0.05),非结核呼吸疾病组显著低于潜伏感染组及健康对照组(p<0.05)。ELISA方法检测结果显示:潜伏感染重组蛋白Rv3287c在四组间特异的Ig G水平差异不显著(p>0.05)。ROC曲线结果:Rv3287c曲线下面积为0.727,在特异度为83%、cut-off值为6个斑点时,健康对照组的阳性率为41.4%,潜伏感染组为50.8%,活动性结核组为14.5%,非结核呼吸病组为29.2%;在特异度为91%、cut-off值为11个斑点时,健康对照组的阳性率为25%,潜伏感染组为38.1%,活动性结核组为7%,非结核呼吸病组为12.5%。综上所述,通过生物信息学预测,MTB Rv3287c是一个T细胞抗原表位占优势的蛋白,B细胞抗原表位比T细胞抗原表位少,是一个无信号肽、不分泌的胞浆蛋白。本研究制备了Rv3287c蛋白,并且发现经过密码子优化后蛋白更容易表达,且效率较高;发现Rv3287c可被结核潜伏感染人群识别,诱导其效应T细胞产生的免疫应答强于活动性结核病患者,也略强于健康对照组,但不能区分健康对照组和潜伏感染组;Rv3287c不诱导机体产生体液免疫应答。