研究背景:理想的药物传递系统可以在增强药物疗效同时降低药物毒副作用。当把安全性,有效性及工艺简便性综合考虑在内时,如何优化药物传递系统仍是一大挑战。微颗粒(MPs)是体内各种细胞在应激时分泌至胞外的包裹胞浆内容物的囊泡样亚细胞结构体,直径约100-1000nm,内含各种信使分子(酶、RNA和DNA分子),可在细胞间通过配体-受体或内吞融合等方式传递生物活性物质。鉴于MPs粒径、结构及功能特点,理论上MPs可以成为良好的内源性生物载体。本研究旨在研究肿瘤细胞膜来源微颗粒(TMPs)作为新型自体来源的生物载体包裹化疗药物甲氨蝶呤(MTX)治疗肺癌合并恶性胸腔积液(MPE)的作用及相关免疫学机制。研究方法:(1)包裹甲氨蝶呤的肿瘤细胞膜来源微颗粒(TMPs-MTX)制备及鉴定:通过将肿瘤细胞暴露于UVB下,加入甲氨蝶呤共孵育24小时,收集细胞上清进行梯度离心分离收获TMPs-MTX,并对其进行鉴定及相关性能研究。TMPs-MTX鉴定包括:通过透射电子显微镜(TEM)分析TMPs-MTX的微观形态和大小,纳米粒径跟踪分析仪(NTA)进行TMPs-MTX的粒径分布及浓度分析,免疫印迹(WB)检测载体TMPs蛋白表达(EpCAM,CD147,CD9,CD63及TSG101),流式细胞术(FCM)散射圈门计数TMPs-MTX,HPLC分析TMPs-MTX负载MTX含量及稳定性。为明确TMPs作为药物载体的可行性,我们体外研究了TMPs载体本身对肺癌细胞(A549,LLC)活性及侵袭能力影响,同时体内研究了TMPs载体对MPE小鼠的肿瘤生长,胸水量及生存期影响。(2)TMPs-MTX体外肿瘤杀伤能力检测:首先,通过将荧光标记的肿瘤细胞来源的TMPs与亲代自体肿瘤细胞共孵育,激光共聚焦及流式检测肿瘤细胞对TMPs摄取情况;TMPs-MTX与亲代肿瘤细胞包括A549(肺)、MCF-7(乳腺)、B16(皮肤)及胸水来源原代肿瘤细胞共孵育,流式细胞术检测肿瘤细胞凋亡情况明确TMPs-MTX体外肿瘤杀伤能力。(3)TMPs-MTX体外对免疫细胞的影响:将小鼠巨噬细胞系Raw264.7细胞,BMDM,健康人PBMC与TMPs-MTX共孵育,激光共聚焦检测其对TMPs-MTX摄取情况并同时流式细胞术检测细胞凋亡情况。以TMPs-MTX导致的凋亡肿瘤细胞刺激小鼠BMDC,检测BMDC表面共刺激分子CD80(B7-1),CD86及MHC II表达,以明确其激活/成熟改变。(4)TMPs载体的靶向及内化研究:健康小鼠尾静脉注射近红外染料DiR标记的TMPs(DiR-TMPs),布鲁克小动物活体成像显示小鼠体内TMPs分布。于指定时间处死小鼠获取内脏后进行再次成像,进一步明确分布情况;构建MPE小鼠模型,分别经尾静脉及胸腔注入DiR-TMPs,活体成像检测DiR-TMPs在MPE小鼠体内分布,于指定时间获取目的内脏后进行成像进一步验证分布情况。为明确TMPs在MPE小鼠中胸腔内具体细胞摄取情况,将PKH67染料标记的TMPs注入胸腔24小时后制备小鼠胸水细胞团及肿瘤的冰冻切片,并进行免疫荧光染色(CD3,CD11b及F4/80抗体),激光共聚焦显微镜下观察绿色荧光PKH67与红色荧光免疫标志物的共定位情况。(5)TMPs-MTX治疗MPE小鼠疗效研究:小鼠通过胸腔注入LLC或MC38细胞构建MPE模型后第五天开始使用TMPs-MTX,TMPs,MTX及PBS对照干预,隔天一次,共三次。第13天小动物活体成像检测小鼠胸膜内肿瘤负荷。第14天处死小鼠后检测小鼠胸膜瘤荷数,胸水体积。免疫组化(CD31抗体)染色检测各组小鼠肿瘤组织的新生血管数量同时免疫荧光染色(TUNEL)明确肿瘤细胞的凋亡指数。同时构建MPE小鼠模型并进行干预进行生存分析。(6)TMPs-MTX治疗MPE小鼠免疫机制研究:同上述MPE造模后干预处理,取小鼠外周血,胸水细胞及胸膜瘤,进行免疫细胞各亚群标记包括T细胞各群(CD45~+FSC~loo SSC~loo CD3~+T细胞,CD45~+FSC~loo SSC~loo CD3~+CD4~+T细胞,CD45~+FSC~loo SSC~loo CD3~+CD4~+FoxP3~+T细胞及CD45~+FSC~loo SSC~loo CD3~+CD11b~-CD8~+T细胞),髓系细胞(CD45~+CD3~–CD11b~+)及巨噬细胞(CD45~+SSC~intnt CD3~-CD11b~+F4/80~+),流式细胞术检测各群比例后分析。(7)TMPs-MTX治疗肺癌合并MPE患者的临床实验:为了验证自体肿瘤细胞来源的微颗粒(ATMPs)作为新型载体包裹化疗药物的抗肿瘤临床效果(安全性和有效性),设计并注册“ATMPs-MTX个体化靶向生物化疗技术治疗恶性胸腔积液”临床研究(美国注册NCT02657460和WHO注册ChiCTR-TRC-14004820)。肺癌合并MPE患者病理明确诊断并成功入组后进行胸腔积液原代肿瘤细胞培养,培养成功后进行ATMPs-MTX胸腔注射治疗,共六次胸腔注射。安全性与可行性是该临床实验的主要终点。安全性以CTCAEv3标准评估。患者的胸腔积液量,临床症状,一般情况及生存期作为次级终点。(8)临床研究相关免疫学改变研究:临床研究中,患者胸腔积液及外周血样本在指定时间被收集,免疫细胞相应的圈门策略见下:CD8~+T细胞(CD45~+CD3~+CD8~+),CD4~+T细胞(CD45~+CD3~+CD4~+),CD4~+调节性T细胞(CD4~+CD25~+FoxP3~+),髓系细胞(CD45~+CD3~-CD11b~+),TAN(CD45~+CD11b~+CD15~+CD66b~+),单核细胞(CD45~+CD3~-CD14~+),TAM(CD45~+CD14~+CD163~+)。研究结果:(1)TEM可见TMPs-MTX呈圆形或杯形为主,直径为1um以内。NTA表明TMPs-MTX具体尺寸分布为30nm至930nm,平均粒径为264nm及中位粒径为196nm。TMPs-MTX浓度不随MTX浓度改变而发生显著改变。WB结果显示TMPs表达A549表面蛋白EpCAM,CD147及CD63,与总细胞蛋白相比低表达CD9及TSG101。流式计数表明2×10~7个LLC细胞加入100ug/ml MTX暴露于UVB辐照可生成约2×10~6个TMPs-MTX颗粒。这些颗粒中包含的MTX浓度经HPLC检测约1ug,且颗粒于4℃贮存3天后裂解经HPLC检测MTX未见降解。体外CCK8检测表明TMP载体本身不影响A549及LLC细胞活性,Transwell实验表明TMPs载体不促进两者侵袭;MPE小鼠模型中,TMPs载体对MPE模型小鼠的瘤荷,胸水生长及生存期无显著影响。体外摄取及杀伤实验中表明TMPs-MTX可被多种肿瘤摄取且有效杀伤肿瘤细胞;而免疫细胞中,TMPs-MTX可被巨噬细胞有效摄取致巨噬细胞凋亡,但极少被T细胞摄取。(2)动物实验结果表明TMPs-MTX可有效降低小鼠胸膜瘤荷,减少胸水聚集,同时小鼠瘤荷内CD31表达降低及TUNEL免疫荧光加强。生存分析表明TMPs-MTX干预组小鼠生存期延长。对小鼠胸水,瘤荷及外周血免疫细胞亚群进行分析后结果表明在MC38小鼠模型中,小鼠经TMPs-MTX治疗后MPE中T细胞各群包括CD3~+T细胞,CD3~+CD4~+T细胞及CD3~+CD8~+T细胞升高,而TAM水平下降。与MPE相似,胸膜瘤内流式分析显示CD4~+及CD8~+T细胞比例均不同程度升高致CD4/CD8比例降低。而LLC小鼠模型中TMPs-MTX治疗后的MPE中免疫细胞总数升高,T细胞比例相较于PBS组无明显变化,但较之MTX组,CD3~+及CD3~+CD8~+T细胞比例明显升高。胸膜瘤荷内CD4/CD8比例亦降低。小鼠MPE及瘤荷内的髓样细胞包括PMN及TAM比例变化与MC38小鼠模型类似(PMN升高,TAM下降);LLC及MC38的MPE小鼠模型的外周血分析表明外周血PMN及巨噬细胞比例升高。(3)“ATMPs-MTX个体化靶向生物化疗技术治疗恶性胸腔积液”临床实验结果表明ATMPs-MTX可有效控制患者胸水,CTCAEv3标准评估表明所有11例患者共六例1-2级的不良事件发生,未见注射相关的急性毒性反应。对患者治疗前后的胸水进行免疫分析表明ATMPs-MTX胸腔注射后,患者胸水中CD3~+T细胞及CD8~+T细胞无明显改变,CD4~+T细胞轻度升高。T细胞亚型进一步分析表明胸水中IFN-γ~+CD3~+T细胞升高,IL-2~+CD4~+T细胞约升高2.5倍及IFN-γ~+CD8~+T细胞约升高2倍。髓系细胞分析表明胸水中髓系细胞总体水平升高。其中3例患者中检测的TAN(CD45~+CD11b~+CD15~+CD66b~+)水平下降。而单核细胞及TAM(CD45~+CD14~+CD163~+)水平则显著下降。此外,胸水中细胞因子/趋化因子检测表明ATMPs-MTX治疗后,TNF-α、IFN-γ(Th1细胞关键细胞因子)及IL-17(Th17细胞关键细胞因子)水平升高。8例患者中6例检测到MCP-1水平降低。其他VEGF、IL-6及IL-10水平未见明显改变。结论:TMPs-MTX是基于TMPs的靶向化疗平台。体外TMPs-MTX可有效杀伤多种肿瘤细胞及巨噬细胞。ATMPs-MTX在C57BL/6小鼠MPE模型中及肺腺癌合并MPE患者中均有良好疗效。我们这项小型临床实验初步表明ATMPs-MTX经胸腔内给药用于治疗肺腺癌合并MPE患者是安全、无毒和可耐受的。此外,动物和临床实验均表明ATMPs-MTX的作用不仅局限于对肿瘤细胞的杀伤,还可能表现为巨噬细胞的耗竭和淋巴细胞活化的增加。本研究通过将ATMPs应用作为新一代的生物相容性的药物载体,为晚期肺癌合并MPE的治疗提供了一个新型的个性化策略治疗。