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miRNAs是一类长度约为1824 nt的小分子单链非编码RNA,能够参与动物基因转录后表达调控,在动物生长、发育、激素分泌及疾病发生等生命活动中均起到极其重要的作用。牛肉优质高产是当前肉牛分子育种研究的重点和热点,牛肉高产主要涉及肉牛肌肉组织发育,牛肉优质主要涉及肉牛脂肪组织发育。因此,本项目以秦川牛为研究对象,构建秦川牛背部肌肉组织及背部皮下脂肪组织不同发育阶段小RNA测序文库,筛选组织特异性和时序特异性表达mi RNAs。然后利用实时定量PCR技术验证测序结果和进行组织表达谱分析,通过双荧光素酶报告基因试验确定重要功能mi RNA的靶基因。进一步通过mi RNA模拟物和抑制剂分别过表达或敲低重要功能mi RNAs,研究其对牛肌卫星细胞增殖分化的影响,以便为秦川牛肉用选育提供新的理论依据及牛肉的优质高效生产奠定理论基础。本次研究主要工作及结果如下:1.秦川牛不同发育阶段肌肉组织小RNA鉴定与分析分别构建秦川牛胚胎期90天、胚胎期200天、出生后5日龄犊牛、12月龄青年牛及24月龄成年牛背部肌肉组织小RNA测序文库,利用深度测序的方法鉴定秦川牛肌肉组织不同发育阶段mi RNA表达规律。原始测序总读数达到75,612,909,去除污染序列得到纯净序列总读数为74,802,970,其中有74.73%的纯净序列被注释为已知mi RNAs,仅代表0.90%的纯净序列种类。最终在秦川牛肌肉组织中共鉴定出510条成熟的mi RNAs,这些成熟序列能够比对上537个mi RNA的前体序列,其中有263个成熟mi RNAs在5个测序文库都表达;同时在秦川牛肌肉组织中共预测得到125条新mi RNAs,其中仅有4个新mi RNAs在5个测序文库中都表达。在出生后肌肉组织中有14个mi RNAs表达量显著上调,而在出生前肌肉组织中有22个mi RNAs表达量显著上调。我们选取12个已知mi RNAs和6个新mi RNAs对测序结果进行RT-q PCR验证和组织表达谱分析,发现novelmir93在肌肉组织中特异性表达且在出生后肌肉组织中显著高表达。提交novelmi R93至数据库mi RBase,并被命名为bta-mi R-10020。2.秦川牛胎牛期和成年期背部脂肪组织小RNA鉴定与分析构建秦川牛胎牛期和成年期背部脂肪组织小RNA测序文库,分别获得原始序列总读数为14,071,065条和14,373,930条。去除污染序列后,分别得到纯净序列总读数为13,915,411和14,244,946,代表870,506条和687,753条纯净序列不同种类。在胎牛期脂肪组织测序文库中,能匹配上mi RBase mi RNAs的序列有8,234,182条,占总纯净序列的59.17%,代表0.56%的纯净序列种类;在成年期脂肪组织测序文库中,能匹配上mi RBase mi RNAs的序列有6,821,393条,占总纯净序列的47.89%,代表0.44%的纯净序列种类。最终在秦川牛脂肪组织两个测序文库中共发现475个成熟mi RNAs,其中在胎牛期测序文库中发现432个已知mi RNAs,在成年期测序文库中发现412个已知mi RNAs,有369个mi RNAs在两个测序文库中都表达;同时在秦川牛脂肪组织两个测序文库中共预测得到36条新mi RNAs对应着65个前体序列,其中共有17个新mi RNAs在两个测序文库中都表达。差异表达分析表明,87个已知mi RNAs在胎牛期文库中表达显著上调,86个在胎牛期文库中表达显著下调。通过RT-q PCR分析12个已知mi RNAs和3个新mi RNAs组织表达谱,发现mi RNAn25和mi RNAn26脂肪组织中显著高表达且在母牛背部脂肪组织中表达量显著上调。3.秦川牛肌肉和脂肪组织mi RNA表达谱特征分析对秦川牛背部肌肉组织和脂肪组织小RNA测序文库进行特征分析,发现mi RNA片段保守长度通常为22 nt,首位碱基偏向于U,第10号位碱基主要为A,种子区碱基一般缺少U。在5个肌肉组织和两个脂肪组织测序文库中,鉴定出的534个已知mi RNAs普遍存在3’端和5’端不同程度的变异。组织差异表达分析表明,在秦川牛脂肪组织中仅bta-mi R-204表达显著上调,在秦川牛肌肉组织中仅bta-mi R-133a表达显著上调。同时534个已知mi RNAs被分为11个mi RNA共表达模块,在脂肪组织中显著上调mi R-204与mi R-143最相关并且被包含在同一模块中,在肌肉组织中显著上调mi R-133a与同一模块中mi R-1相关最显著。4.mi RNA靶基因预测、功能分析及表达研究预测出生前后秦川牛肌肉组织36个差异表达mi RNA靶基因,共得到3069个靶基因,功能注释表明这些靶基因参与肌肉生长发育相关的多种生理和病理调控过程;脂肪组织显著高表达mi RNAn25和mi RNAn26分别预测得到2416个和672个靶基因,其中有126个mi RNAn25靶基因和44个mi RNAn26靶基因与脂肪形成或脂滴沉积等过程显著相关。肌肉组织特异性表达且在出生后肌肉组织中显著高表达mi R-10020,预测得到1359个靶基因,功能注释表明有27个靶基因与肌肉组织生长发育密切相关。实时定量PCR分析这27个靶基因,结果表明基因MYLPF、MYL3及ANGPT1具有肌肉组织表达特异性,基因KLF4和CAPN3在肌肉和脂肪组织中高表达。5.bta-mi R-10020靶基因鉴定及功能研究为了验证MYLPF、MYL3、ANGPT1、KLF4和CAPN3基因是否是mi RNA-10020的直接靶标,我们构建了以上5个基因野生型和突变型两种荧光素酶报告基因重组载体。共转染重组载体与mi R-10020模拟物进HEK293T细胞系,进一步通过分析报告基因荧光素酶活性的变化,确定mi R-10020与ANGPT1 3’UTR之间存在直接互作。同时构建ANGPT1基因p Ds Red-N1野生型和突变型重组载体并与mi R-10020模拟物共转染C2C12细胞系,确定mi RNA-10020是通过抑制ANGPT1基因翻译过程起作用。在牛肌卫星细胞原代培养细胞系中转染mi RNA-10020模拟物和抑制剂,分别在转染24 h、48 h和72 h后收集细胞提取总RNA。RT-q PCR检测表明,在转染24 h后牛肌原代细胞系中成熟mi R-10020表达水平开始显著升高,同时在转染72 h后牛肌原代细胞系中内源性mi RNA-10020表达水平开始显著降低。结果表明,mi RNA-10020模拟物发生作用周期较短,而抑制物发生作用周期较长,一般为72 h左右。用生长培养基培养牛肌原代细胞系过程中,过表达mi RNA-10020 48 h后,能够显著下调Pax7基因表达,但对Myf5基因表达影响不显著,但通过mi RNA-10020抑制剂抑制内源性mi RNA-10020表达对Pax7和Myf5基因表达水平影响不显著。用诱导培养基培养牛肌原代细胞系过程中,过表达或敲低mi R-10020,Myo D、Mef2c和Myo G基因表达水平无显著变化。