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肌肉生长抑制素(Myostatin,MSTN),又名抑肌素、生长分化因子8(GDF-8),属于TGF-β超家族,其功能主要是作为一种骨骼肌生长的负调控因子,限制肌肉超常发育。该基因的缺失或突变会使肌细胞增生和肥大,机体表现为双肌性状。近年来,研究发现MSTN不仅可调控肌肉生长发育,在肌肉稳态中起关键作用,而且还影响脂肪形成和骨骼发育,并与胰岛素敏感性有关。对MSTN基因的深入研究在畜牧业及医学领域具有重要意义。因此,有关MSTN基因与多种疾病的关系及其在机体代谢中的作用受到广泛关注。RNA干扰(RNA interference,RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。该技术可以简便、快速、高效、特异性的抑制基因的表达,因此受到了各个领域研究人员的重视。本文拟构建靶向MSTN基因的pSIREN-MSTN-shRNA表达载体,并使用不同的体内转染方法转染小鼠并比较其体内干扰效果,为后续开展相应的MSTN基因功能研究奠定工作基础。本文首先根据MSTN基因的mRNA序列设计siRNA,并挑选出3条可能具有良好干扰效果的siRNA,设计合成shRNA,构建pSIREN-MSTN-shRNA表达载体。通过肌肉注射法将载体递送至小鼠体内,利用实时荧光定量PCR和Western blot检测瞬时干扰后小鼠肌肉组织中MSTN的mRNA表达量和蛋白质表达水平。测序结果表明pSIREN-MSTN-shRNA表达载体构建成功,3个重组质粒均能够明显降低肌肉组织中MSTN的mRNA和蛋白质水平,其中pSIREN-M664和pSIREN-M819表达载体干扰效果较好,与对照组相比,MSTN的mRNA表达量分别降低了65%和71%,蛋白水平也明显降低。因此,选用pSIREN-M664和pSIREN-M819表达载体通过肌肉注射法、PEI/shRNA复合物和脂质体介导的雾化转染3种方法,将干扰质粒导入小鼠体内研究其干扰效果。结果显示通过肌肉注射法进行小鼠体内干扰实验抑制效果最好。在使用肌肉注射的方法将重组质粒载体导入小鼠体内时,每只小鼠每次注射100μg质粒,每周1次,共注射4次。最后一次注射结束3 d后,断颈法处死小鼠并称重解剖,结果发现,与pSIREN-NC对照组相比,pSIREN-M664和pSIREN-M819干扰质粒处理组小鼠的体重分别增加8.75%和4.38%。通过Western blot检测干扰后小鼠肌肉组织中MSTN蛋白质表达水平,结果表明,干扰质粒pSIREN-M664和pSIREN-M819均可以显著抑制小鼠体内MSTN蛋白表达。肌肉组织切片HE染色结果显示肌纤维增粗。与对照组相比,pSIREN-M664处理组小鼠肌纤维面积增大25%。综上所述,本研究成功构建了靶向MSTN基因的pSIREN-MSTN-shRNA表达载体,并获得了在小鼠体内具有良好抑制效果的干扰质粒pSIREN-M664。为后续通过RNA干扰技术调控MSTN基因表达以改善和治疗MSTN相关疾病奠定基础。