牦牛皮胶原蛋白的提取及其活性肽的制备

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我国牦牛资源丰富,因其独特的环境优势,牦牛皮中多种成分具有显著的功能特性,如抗缺氧、风湿等功效。本文围绕牦牛皮中胶原蛋白进行相关研究,提取三种胶原蛋白,测定其理化性质;以自由基清除率为指标,制备胶原蛋白抗氧化肽,优化酶解工艺,探究其功能特性及抗氧化稳定性;最后通过多种纯化手段分级分离抗氧化肽,测定肽段的抗氧化能力,鉴定抗氧化肽序列。为进一步丰富胶原蛋白领域研究,获得高品质胶原蛋白奠定一定的理论基础。主要研究结果如下:(1)成功提取了三种胶原蛋白:酸溶性胶原蛋白(ASC)、酶溶性胶原蛋白(PSC)、水溶性胶原蛋白(HWSC)。紫外、红外光谱及电泳分析表明ASC和PSC属于Ⅰ型胶原蛋白,分子组成类型为(α1)2α2型;HWSC则为三螺旋结构被破坏的明胶。ASC、PSC、HWSC均含有丰富的亚氨基酸,分别为264.1残基/1000残基、276.6残基/1000残基、274.9残基/1000残基;热稳定性较好,显著高于其他动物胶原蛋白。扫描电镜(SEM)观察到PSC更具松散、均匀的孔径结构。自组装浊度实验证实PSC的组装程度高于ASC,成纤维性能强。透射电子显微镜(TEM)测定表明ASC和PSC具有典型的D-周期性横纹结构,D-周期分别为(68.2±5)nm、(69.3±3)nm。(2)利用碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶分别酶解牦牛皮胶原蛋白,以·OH、DPPH·、O2-·的清除率为指标,制备牦牛皮胶原蛋白抗氧化肽。选取碱性蛋白酶为最佳水解用酶,在单因素的基础上,利用响应面优化工艺,得到最佳酶解条件为:酶解时间6.99 h、酶添加量6355.04 U/g、底物浓度3.55%。在此条件下获得的·OH自由基的清除率为83.12%。(3)功能性质测定发现:牦牛皮胶原蛋白抗氧化肽的溶解性均高于85%。乳化性及起泡性均随着p H的升高,呈现先降低后升高的趋势。抗氧化肽吸水性较好,持水性较差。当温度达40℃时,抗氧化肽有最大吸油能力。抗氧化稳定性测定显示:牦牛皮胶原蛋白抗氧化肽具有较好的耐热、耐酸性能,但在碱性条件下活性降低。经体外模拟胃肠道反应后抗氧化能力降低为60%左右,但仍具有一定的耐受胃肠道酶系消化的能力。(4)分离鉴定牦牛皮胶原蛋白抗氧化肽。通过超滤、凝胶过滤层析和反向高效液相色谱分离技术,根据肽的分子量大小、极性的不同对牦牛皮胶原蛋白抗氧化肽进行分离纯化,进而得到抗氧化活性较高的组分Ⅰ-D7。采用质谱分析鉴定出牦牛皮胶原蛋白抗氧化活性肽的氨基酸序列为Phe-Leu-Pro-Gln-Pro-Pro-Gln-Glu,分子量为954.5。
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