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本文主要从以下两个部分展开论述: 第一章 Calyx of Held突触囊泡循环的动力学研究 突触囊泡的循环对于维持神经信息的可靠传递至关重要。囊泡循环主要包括了囊泡与突触前膜融合释放神经递质,前膜内吞形成新的囊泡,而后通过酸化、神经递质重填充,最后锚定以及动员作用再次成为具有释放能力的囊泡等一系列过程。然而,以往的研究往往集中于囊泡的释放与内吞这两个过程,对于内吞以后囊泡的活动缺乏有效的了解。到目前为止,由于研究手段和检测技术的局限性,有关囊泡循环的一些基本特性仍存在巨大的争议,例如循环囊泡池(recycling pool,RP)的大小是多少,囊泡内吞以后经过多久能够再次使用,不同的囊泡回收机制是否意味着不同的再利用动力学,以及囊泡的循环机制如何有效地维持突触传递。 在本研究中,在小鼠脑片上采用局部灌流囊泡ATP酶(Ⅴ-ATPase)的阻断剂folimycin抑制内吞后囊泡酸化的手段,针对上述争议提出了一种具有高效的时间和信号分辨率的定量分析方法,来研究calyx of Held这一谷氨酸能突触中囊泡循环的动力学特征。在验证了folimycin药物能够有效且特异性地阻断内吞后囊泡的神经递质重填充后,我们估算了循环池的容量约为270000个囊泡,且不随着刺激频率的改变而发生变化。我们在1s左右的时间内未观察到囊泡的快速再利用,而是发现内吞后的囊泡经过了几十秒的时间后再次被释放,并且再利用时间与刺激频率呈现相关性。当我们统计再利用时间点相对应的囊泡释放量时发现,在20 Hz和50 Hz频率下,大约47%的循环池囊泡被释放时,内吞回收的囊泡才会再次被利用。这一结果暗示了突触囊泡再利用的时间表面上显示出频率依赖性,而本质上与循环囊泡池的使用比例相关,同时也提示了循环囊泡池的非均一性。结合循环池囊泡释放所展现出的两个动力学成分,上述结果提示了在突触囊泡动员阶段之前存在着一个大小有限且可以填充预备释放池(readily releasable pool,RRP)的囊泡池,我们将其命名为预备动员池(readily priming pool,RPP)。因此我们提出了一个囊泡循环顺序释放的动力学模型,将循环池进一步分为预备释放池,预备动员池和成熟前池(pre-mature pool,PMP),并分别计算出了各个囊泡池的容量。 研究主要采用电生理记录的手段,验证了calyx of Held突触循环囊泡池的容量以及循环的动力学特性,并原创性的提出了预备动员池这一概念。通过建立模型来分析和拟合实验数据,我们计算出循环池各个亚池的大小:预备释放池为0.79%,预备动员池为57.53%,成熟前池为41.54%。 第二章 Calyx of Held突触长时程增强的诱导和确认 突触的长时程可塑性包括了长时程增强(LTP)和长时程抑制(LTD),它被认为是神经系统信息处理和存储的重要表现形式。LTP发生的分子机理有多种不同的途径,而目前研究比较深入的是突触后NMDA受体依赖的LTP。对于NMDA受体依赖的LTP,其长时程增强是由突触后AMPA受体通道电导或受体数量的增加引起的。一般认为,受体数量的增加是通过突触后神经元经过胞吐作用和/或侧向扩散至突触后致密带上完成的。然而,在LTP产生时上述机制发生的时序关系目前还不清楚。受到现有研究标本的形态和大小的限制,对于AMPA受体胞吐的位置、时间,侧向扩散的动力学等都存在着争议。 Calyx of Held是位于脑干听觉通路中一个特殊的轴突-胞体型突触,广泛应用于突触传递的研究,而有关calyx的长时程可塑性却鲜有报导。Calyx突触后为胞体结构,可以使用多种方法对其膜电容、钙电流等进行定量测定和控制,是研究突触可塑性的一个良好的标本。我们的研究在接近生理温度下先后使用了高频刺激和配对刺激的方法在幼年期calyx突触上成功地诱导了LTP。伴随着兴奋性突触后电流(EPSC)的增大,miniature EPSC(mEPSC)在诱导后显著性增大,而突触前囊泡释放概率保持不变,显示了是突触后而非突触前相关机制介导了calyx突触中LTP的产生。利用calyx突触后膜电容检测技术并未发现在LTP诱导期间突触后膜电容有明显增加,暗示了包含AMPA受体的囊泡胞吐发生在LTP诱导之后。鉴于calyx突触具有对突触前、后直接进行双膜片钳记录的优势,在此突触上发现并证实LTP的存在为深入开展长时程可塑性研究提供了新的标本和平台。