论文部分内容阅读
光合膜蛋白细胞色素b6f复合体(Cytochrome b6f complex,简称Cyt b6f)是光合电子传递链中三个重要的膜蛋白复合体之一,位于光系统II和系统I之间,介导两个光系统之间的电子传递,同时作为质子泵跨膜转运质子,为ATP合成提供能量。Cyt b6f除了4个大亚基和4个小亚基的蛋白组分之外,每个单体还结合1分子的叶绿素a(chlorophyll a,Chl a)和1分子的类胡萝卜素(carotenoid,car)。研究表明,复合体中Chl a在光照条件下非常稳定,其单线激发态(singlet excited state,1Chl a*)寿命很短,仅为~200ps,荧光产率为~1.8%;而在甲醇中1Chl a*寿命为5~6ns,荧光产率为20%~30%。推测该Chl a光稳定的原因是Cyt b6f特殊的蛋白环境快速猝灭了*Chl a,使Chl a荧光产率随之降低,最终导致Chl a三线态(triplet excited state,3Chl a*)和随后的单线态氧(1O2*)产率降低,但是目前对这一推测尚缺乏有力的实验证据。根据Cyt b6f2.7分辨率的晶体结构[1],Chl a处于精细蛋白环境中,其中心Mg离子和H2O分子配位,并且该H2O通过氢键与复合体亚基IV的氨基酸G136和T137相互作用。本研究基于这一结构,1)以集胞藻6803(synechocystis sp. PCC6803)为材料,利用分子生物学手段,对Cyt b6f亚基IV的G136、T137氨基酸定点突变;2)运用生化手段分离纯化Cyt b6f蛋白制剂;3)研究野生和突变Cyt b6f蛋白制剂在强光条件下稳定性的差异;结合时间分辨光谱(Time resolved spectrometry,TRS)技术比较不同样品中Chl a荧光寿命的的差异。研究结果如下:1)获得了3株集胞藻6803Cyt b6f氨基酸定点突变株,即2个单突G136A和T137A,1个双突G136A/T137A;2)以野生和突变菌株为材料,分离纯化了野生和3个突变Cyt b6f蛋白样品;3)通过对野生和突变样品的光破坏实验,发现突变不仅导致蛋白与Chl a结合能力下降,而且显著降低了Chl a的光稳定性。在强光照条件下,Cyt b6f中Chl a稳定性由高到低顺序为:野生>单突T137A>单突G136A>双突G136A/T137A。TRS实验表明,野生Cyt b6f样品中Chl a的荧光寿命为~240ps,与文献报道吻合;而双突G136A/T137A中,Chl a荧光寿命延长到~470ps。上述结果表明在Cyt b6f中,Chl a所处的精细的蛋白环境,特别是复合体亚基IV的氨基酸G136和T137与Chl a形成的氢键网络对其稳定性具有重要的作用。