研究背景及目的正畸治疗过程中,外力通过矫治器作用于牙齿,传递至牙周膜,引起牙周组织、牙槽骨的生物力学反应,最终移动牙齿而达到矫正的目的。力学刺激由牙齿传递到牙周组织,牙周膜发挥了重要的桥梁作用。牙周膜是位于牙根和牙槽骨之间的一层质地紧密的结缔组织膜,由细胞和基质纤维构成。作用到牙齿上的力刺激经牙周膜进一步传递至牙根周围的牙槽骨。牙周组织改建成功与否关键在于牙周膜干细胞(periodontal ligaments stem cells, PDLSCs),它既是正畸矫治力的直接感应细胞,能将机械应力转化为胞内外的生物化学信号；又是正畸力的效应细胞,在外力作用下可分泌并释放多种细胞因子及生长因子,还可能同时参与骨吸收和骨形成过程。有研究表明,PDLSCs含有具备分化潜能的成纤维细胞群,正畸机械作用力可诱导PDLSCs向成骨细胞向分化,进一步参与骨形成与骨吸收,这是正畸牙槽骨改建重塑的关键所在。当PDLSCs受到力学刺激后,机械和物理信号转换为细胞内生化信号的分子机制是十分复杂的,包括多条信号转导途径。例如,一氧化氮(NO)、骨形成蛋白2(BMP2)、转化生长因子β1 (TGF-β1)、前列腺素12(PGl2)、前列腺素E2 (PGE2)、动力敏感钙离子通道等。近来也有研究表明细胞核内调控基因转录的相关骨形成转录因子也参与了这一复杂的调控途径。我们的前期实验已经证实了转录激活因子4(Activating transcription factor-4, ATF4)参与了正畸牙齿移动这一过程,在施加正畸力后ATF4的表达上调,过表达ATF4后成骨相关因子表达量也升高,进一步促进PDLSCs成骨分化。ATF4是cAMP反应元件结合转录因子家族成员之一,它能调节成骨细胞分化和骨形成,而蛋白激酶R样内质网激酶(protein kinase R like endoplasmic reticulum kinase, PERK)在ATF4的上游发挥作用。PERK是一种位于内质网膜上的Ⅰ型跨膜蛋白,它的结构包括信号肽、跨膜结构域,其N端位于内质网腔内,C端位于胞浆侧。内质网是真核细胞内一种很重要的细胞器,是蛋白质翻译合成和储存钙离子的场所。当细胞受到缺氧、钙离子平衡失调等刺激时,内质网内一些未折叠或错误折叠的蛋白质累积,内环境的Ca++浓度改变,进而导致内质网结构和功能的失衡,此时相应的信号通路将激活,引发内质网应激(Endoplasmic Reticulum Stress, ERS)。 ERS主要由内质网膜上的三种蛋白-PERK, ATF6,肌醇酶1 (inositol requiring enzym E1, Ire1)介导,其中PERK的激活处于内质网应激的中心地位,作用涉及PERK-eIF2a-ATF4信号通路。在ERS条件下,PERK被激活,导致真核细胞起始因子2a (Eukaryotic initiation factor 2a, eIF2α)磷酸化,进而减弱下游的因子的翻译表达来抑制蛋白质的合成。但与其他因子不同的是,ATF4能够“躲避”eIF2α磷酸化的作用,在eIF2α磷酸化的情况下能够上调ATF4,产生一系列效应。有学者发现在心血管、肾脏等组织器官内以及软骨细胞增殖分化过程中,力学刺激上调ATF4表达涉及PERK,也有研究表明PERK-eIF2a-ATF4信号通路介导的ERS参与成骨细胞的成骨向分化；正畸牙移动有赖于力刺激下牙周组织和骨组织的改建,其中成骨细胞在骨形成和破骨细胞附着分化方面有重要作用,受力PDLSCs的PERK、ATF4表达上调,而二者均与细胞内蛋白质的氧化折叠有关,是内质网应激中的重要信号分子。由此推测内质网应激介导的PERK-eIF2α-ATF4信号通路可能参与正畸加力时牙周组织改建过程,并发挥重要的调节作用。但关于内质网应激介导的PERK-eIF2α-ATF4信号通路在正畸牙齿移动中牙周膜干细胞成骨分化的作用国内外均未见报道。本研究通过人牙周膜干细胞的原代培养,构建牙周膜干细胞体外培养-力学刺激模型,并检测不同加力时间点后内质网应激相关因子和成骨相关基因的表达的水平变化,并在此基础上,采用慢病毒质粒包装构建过表达、沉默表达PERK的稳定细胞系,对正常牙周膜干细胞和病毒转染的牙周膜干细胞实施应力刺激,研究ERS介导的PERK-eIF2α-ATF4信号通路在牵张力作用下牙周膜干细胞的成骨向分化过程中的作用。本课题试图阐明力学因素下PERK-eIF2a-ATF4信号通路在调控人牙周膜干细胞成骨分化过程中的作用,为临床矫治提供理论依据,为进一步研究正畸牙槽骨改建的分子生物学机制提供科学依据,提高矫治效果提供新的思路和方向。研究方法1.人牙周膜干细胞分离培养及鉴定采用传统的组织块法分离培养人牙周膜干细胞,从而获得原代人牙周膜干细胞。传代后对细胞进行形态学观察,并利用血细胞计数板对细胞进行计数,绘制生长曲线。通过免疫细胞化学染色和流式细胞术对培养的人牙周膜干细胞进行鉴定。2.观察牵张力加载下人牙周膜干细胞内质网应激相关因子及成骨相关因子的表达变化选择第4-6代生长旺盛,性质稳定的人牙周膜干细胞进行实验。将细胞以2.5×105/孔的密度接种于BioFlex弹性膜六孔培养板上,培养24小时后换用含2%胎牛血清的条件培养基,继续培养24小时后将培养板置于多通道细胞牵张应力加载系统中,对细胞施加振幅10%,频率0.5HZ的周期性牵张力,加力作用时间为1h,3h,6h,12h,18h,24h。在相应的时间点,提取总RNA和核蛋白,采用荧光定量PCR和Western Blot测定内质网应激相关因子(Bip, Xbp1, PERK, eIFα, p-eIF2α)及成骨相关基因ATF4, OCN, BSP的表达变化。3.分析PERK-eIF2α-ATF4信号通路在牵张力作用下牙周膜干细胞成骨分化中的作用利用上海吉凯公司设计合成并进行慢病毒包装获得过表达PERK基因的慢病毒,干扰PERK基因的慢病毒以及阴性对照的慢病毒。对人牙周膜干细胞进行病毒转染,构建过表达和沉默PERK的牙周膜干细胞模型,随后进行靶细胞感染预实验以及病毒感染复数(MOI)值得摸索,利用最佳MOI值对靶细胞进行感染,通过荧光定量PCR以及Western Blot证实稳定转染过表达和干扰PERK的牙周膜干细胞内PERK的mRNA和蛋白水平。采用茜素红染色来评价基质矿化的程度,同时对感染病毒的细胞也进行了牵张力的加载,拉伸强度10%,频率0.5HZ,加力12h。采用荧光定量PCR和Western Blot检测p-eIF2α和成骨相关基因-ATF4, OCN和BSP的表达水平来进一步分析PERK-eIF2α-ATF4信号通路在牙周膜干细胞成骨分化中的作用。结果1.采用组织块法成功分离培养了原代的人牙周膜干细胞,传代后牙周膜干细胞生长旺盛,状态良好,形态上具备成纤维细胞的特性,约传代后2-3天开始指数增长,8天达到峰值。人牙周膜干细胞通过染色发现波形丝蛋白阳性,角蛋白染色阴性证明其为来源于间充质的细胞群,并通过成骨诱导和成脂诱导表明人牙周膜干细胞具有多向分化能力。2.人牙周膜干细胞在牵张力作用下形态发生一些变化,细胞明显被拉伸,在培养板上逐渐呈方向性生长。细胞加力后内质网应激相关因子(Bip,Xbpl,PERK, eIF2α, p-eIF2α)及成骨相关基因(ATF4,OCN, BSP)的表达均发生了一些变化。Bip在加力后6h之内变化不明显,12h-24h后表达量逐渐增加；Xbp1的变化略有一些波动,在加力3h和6h后表达略有下降,但12h后表达又开始上升。PERK表达量在加力后逐渐增加,加力3h和6h时表达达一个峰值,随后随时间延长逐渐恢复到一个稳定的水平；p-eIF2α的表达在加力早期升高不明显,随加力时间增加而表达量升高,6h达峰值,而eIF2α基本没变化。另一方面,成骨相关基因-ATF4,骨钙素(OCN)和骨涎蛋白(BSP)的表达水平基本上随加力时间延长而升高。ATF4在加力早期1h后就急剧升高并达到峰值,3h和6h时有所下降,后随加力时间逐渐升高；OCN和BSP变化比较有规律,随加力时间延长而表达量逐渐增加。结果证实了周期性张应力可以促使内质网应激相关因子的表达以及牙周膜干细胞相关成骨基因的表达。3.采用慢病毒对细胞进行转染处理,荧光显微镜下可见在转染后72h后病毒转染效率最高。荧光定量PCR以及Western Blot证实稳定转染牙周膜干细胞在过表达PERK后PERK mRNA和蛋白水平都得到显著的提高,而在PERK干扰后PERKR的mRNA和蛋白水平显著下降,并且单独转染阴性载体的牙周膜干细胞与正常牙周膜干细胞无明显差异,慢病毒转染成功。茜素红染色实验发现了PERK过表达的牙周膜干细胞体外培养3周后可以观察到钙结节,说明PERK的过表达促进了牙周膜干细胞的成骨分化；而PERK干扰的牙周膜干细胞体外培养3周后几乎看不到钙结节,说明PERK干扰抑制了牙周膜干细胞的成骨分化。通过荧光定量PCR和Western Blot对牙周膜干细胞内相关成骨基因的水平进行测定,证实了PERK过表达可以有效促进p-eIF2α, ATF4, OCN和BSP的表达,牵张力刺激增加这一效应,而PERK抑制减少了p-eIF2α, ATF4, OCN和BSP的表达,在牵张力刺激下,对p-eIF2α, ATF4, OCN和BSP的表达有所升高但不如PERK过表达组和PERK过表达同时加力组。结论1.牵张力刺激促进内质网应激相关因子(Bip, Xbp1, PERK, p-eIF2a)及成骨相关基因(ATF4, OCN, BSP)的表达变化,牵张力刺激可以在一定程度上诱发内质网应激的发生,从而进一步激活PERK-eIF2a-ATF4信号通路。2. PERK过表达可以促进钙离子的沉积和基质矿化程度,进而促进牙周膜干细胞成骨分化；而PERK干扰则减少钙离子的沉积和基质矿化程度,抑制牙周膜干细胞成骨分化。3.内质网应激介导的PERK-eIF2α-ATF4信号通路参与了牵张力作用下牙周膜干细胞成骨分化的过程。PERK过表达可以有效促进p-eIF2P, ATF4, OCN和BSP的表达,牵张力刺激增加这一效应,牵张力刺激和PERK过表达对牙周膜干细胞成骨基因表达有协同作用；而PERK抑制减少了p-eIF2α, ATF4, OCN和BSP的表达。意义和创新点本课题首次研究了由内质网应激所介导的PERK-eIF2α-ATF4信号通路在牵张力作用下牙周膜干细胞成骨分化过程中的作用,提出了周期性牵张力作为一种应激刺激可以激活内质网应激反应；并建立了体外加力刺激模型,更好的模拟了体内受力环境和受力条件；同时我们采用了过表达和干扰目的基因片段的技术方法,从细胞力学角度和分子生物学角度证明了PERK-eIF2α-ATF4信号通路参与了牵张力作用下牙周膜干细胞的成骨分化,并且过表达PERK可促进周期性牵张力介导的牙周膜干细胞向成骨向分化。这有助于我们更好地理解牙周膜干细胞成骨分化的细胞生物学机制以及进一步探索牙齿移动过程中牙周组织重塑的机理,为临床上实现牙齿快速移动提供一定的理论依据。