脂肪酶能催化酯键水解及其逆向反应,并具有稳定性好、选择性好等特点,因此在生物催化领域有广泛的应用。脂肪酶广泛存在于动物组织、植物种子和微生物体中,其中微生物来源的脂肪酶在生物催化中应用的最多。本课题对一株自行筛选的变形杆菌属Proteus sp. K107产的脂肪酶LipK107进行了克隆、表达与酶学性质的研究,探讨了其在生物柴油的合成和手性拆分反应中的应用,并结合计算机模拟初步研究了其结构中“盖子”区域和催化三联体与脂肪酶催化功能的关系。第一部分：产脂肪酶菌株的筛选、鉴定及其脂肪酶基因的克隆与序列分析。从环境土壤中筛选得到一株高产脂肪酶的菌株K107。通过16srDNA的克隆、测序、分析确定所筛选的菌株为变形杆菌属(Proteus sp.);以Proteus sp.K107的基因组为模板,根据已报道的脂肪酶基因序列设计简并引物,利用GenomeWalker法分段克隆并拼接得到完整的脂肪酶基因序列。经分析得出,脂肪酶基因lipK107的开放阅读框有864个碱基,编码287个氨基酸,是迄今为止已报道的第二条来源于变形杆菌属的脂肪酶基因。同源性分析表明,LipK107的蛋白序列与来源于同属的LipK80有79%的同源性,而与其他脂肪酶只有不足50%的同源度。第二部分：脂肪酶LipK107在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达、纯化及基本酶学性质的研究。将脂肪酶基因lipK107克隆于质粒pET28a中,并转化大肠杆菌BL21(DE3)。经条件优化后,LipK107在大肠杆菌BL21(DE3)中主要以可溶于胞内的形式高效表达。通过亲和层析纯化后的脂肪酶LipK107的基本酶学性质研究表明,在以对硝基苯酚酯为水解底物时,其最适底物为对硝基苯酚月桂酸酯,水解比活达1200 U／mg；温度、pH及稳定性实验表明LipK107的最适水解温度为35℃,最适pH为9.0,并且具有较好的热稳定性和pH稳定性。在反应体系中加入终浓度为5 mM的钙离子可将LipK107的比活提高43%,表明LipK107有钙离子激活现象。此外,LipK107对甲醇等极性较强的有机溶剂的耐受性较好,正己烷、异辛烷等极性较低的有机溶剂对LipK107的酶活也影响甚微,有利于LipK107在有机相中的反应。第三部分：全细胞催化剂的制备及其在催化生物柴油合成中的性能研究。将表达脂肪酶基因lipK107的大肠杆菌BL21(DE3)制备成全细胞催化剂,并首次报道了以大肠杆菌细胞作为催化剂合成生物柴油。考察了温度、水含量、底物摩尔比、操作稳定性等参数对反应转化率的影响,结果发现：(A)十六烷基三甲基溴化铵可以提高细胞通透性,从而极大地提高反应效率,反应12 h后转化率接近100%；(B)最适反应温度15℃(一般为35-50℃)在生物柴油的合成中是首次报道,LipK107在10-25℃表现出较好的转酯活性是其不同于其它脂肪酶的独特优点；(C)可以在水含量达到30%-100%(对底物油脂的质量百分比)的高水含量体系中有效地催化合成反应,一定程度上解决了由于底物水含量过高而影响转化效率的问题,并减少了底物选择上的限制；(D)可以在油脂与甲醇的摩尔比为1：5的体系中催化反应,有效地解决了酶因为甲醇的毒性而失活的难题；(E)可以催化多种油脂,具有应用的广泛性；(F)操作稳定性较好,使用丙酮洗涤每次反应后的菌体,可以使催化剂反复应用5次以上。以上结果均表明表达脂肪酶LipK107的大肠杆菌全细胞催化剂在生物柴油合成中的应用潜力。第四部分：LipK107手性选择性的确定及其对α-苯乙醇拆分的研究。首先,温度是影响反应转化率和产物eep的显著因素,LipK107催化α-苯乙醇拆分反应的最适反应温度为20℃(一般为35-50℃),进一步表明脂肪酶LipK107在催化有机相反应时的低温特性。其次,LipK107可以在水含量100%-300%(对底物α-苯乙醇的质量百分比)的高水含量体系中有效地拆分α-苯乙醇,反应最适宜的酰基供体是长链的十七烷酸甲酯。通过优化反应的最适酶添加量,底物的最适摩尔比,有机溶剂的影响等条件,明显地提高了反应的转化率和产物的eep,24 h内底物转化率达到30.3%,eep达到95.9%,表明脂肪酶LipK107具有较好的手性催化能力。第五部分：计算机模拟与定点突变技术的结合及LipK107“盖子”结构和催化三联体与脂肪酶活性的关系的初步探索。借助于脂肪酶LipK107的计算机模拟结构,对其进行分析,表明LipK107具有保守的催化三联体及活性中心上方的“盖子”结构。通过对“盖子”结构特性的分析,设计突变位点,并与定点突变技术相结合,构建了5个突变体脂肪酶。试验结果表明增强“盖子”的疏水性可将LipK107的水解比活提高13.3%,转酯活性提高51.1%,并促进脂肪酶对长链底物的选择性及其手性选择性；而降低“盖子”区域的疏水性或静电性导致LipK107的水解比活和转酯活性降低70%以上,并对脂肪酶的选择性产生不利影响。以上结果均与计算机模拟预测结果相符,表明脂肪酶的“盖子”结构对其活性有着重要的调节作用,对“盖子”结构的改造能够改善脂肪酶的性质,提高脂肪酶的活性。通过对LipK107计算机模拟结构的分析构建3个突变体分别考察破坏脂肪酶的催化三联体(Ser79,Val232,His254),构建新的催化三联体(Ser79, Asp103, His254)和构建“两个催化三联体”(Ser79, Asp232, His254和Ser79, Asp103, His254)对LipK107活性的影响。水解反应和有机相反应结果均表明,改变脂肪酶的催化三联体会导致脂肪酶活性降低90%以上,脂肪酶天然的催化三联体对脂肪酶而言是至关重要的。