Pyrococcus furiosus是分离自意大利Vulcano岛Porto di Levante海岸的地热海底沉积物中的极端嗜热古生菌,其最适生长温度为100℃。P. furiosus能以蛋白质作为唯一碳源、氮源和能源生长,其胞外蛋白酶在细胞的蛋白质代谢中发挥重要作用。极端嗜热蛋白酶pyrolysin是来源于P. furiosus的一种与细胞外层结构相结合的胞外蛋白酶。Pyrolysin具有优良的高温活性和热稳定性,其最适反应温度为115℃,100℃的半衰期为4h,是目前已知的热稳定性最强的蛋白酶之一,可以作为研究蛋白质在接近生命极限温度条件下发挥功能以及维持蛋白质结构稳定性的分子机制的理想材料。Pyrolysin属于枯草杆菌蛋白酶类丝氨酸蛋白酶(subtilase),其一级结构包括Ⅲ型信号肽、N端前肽、N端催化结构域以及C端延伸区。作为胞外蛋白酶,pyrolysin是在高温和富含金属离子的海水中完成加工成熟过程和发挥生理功能的。虽然已有报道对该酶的热稳定机制进行了研究,但金属离子在其中是否及如何发挥作用尚不清楚。同时,S层蛋白是P. furiosus细胞外层结构中的主要组分,作为与细胞外层结构相结合的蛋白酶, pyrolysin的功能发挥是否与S层蛋白有关也未知。在本研究中,我们重点探讨了金属离子及S层蛋白对pyrolysin的成熟及性质的影响,进一步了解pyrolysin适应极端高温海洋环境并发挥生理功能的分子机制,同时为人们改造天然蛋白质从而提高其热稳定性提供新的理论依据。首先,我们研究了海水中主要金属离子(Na+、Ca2+、Mg2+)对pyrolysin酶原的加工成熟过程及其成熟酶的高温活性和热稳定性的影响。结果显示,这些金属离子对pyrolysin具有双重作用：一方面,随着金属离子浓度的提高,pyrolysin的酶原和成熟酶均发生沉淀和变性；另一方面,金属离子的存在对成熟酶的活性具有促进作用。根据pyrolysin的分子结构特征,我们推测金属离子可能通过与该酶分子表面富含的带负电荷氨基酸残基之间的静电相互作用来影响pyrolysin的结构与性质。随后,我们对pyrolysin的分子结构特征和可能的Ca2+结合位点进行预测,并对可能参与Ca2+结合的氨基酸残基进行突变分析,证实pyrolysin至少含有两个高亲和力的Ca2+结合位点,即Cal位点和Ca2位点。其中,Cal位点位于pyrolysin的催化结构域,Ca2位点位于pyrolysin的C端延伸区。实验结果表明这两个Ca2+结合位点均与pyrolysin的热稳定性相关。值得注意的是,将Ca2位点中第818位和第820位天冬氨酸残基替换为天冬酰胺后,突变体对Ca2+亲和力未发生明显变化,但其活性和热稳定性显著提高。我们推测这可能是由于天冬酰胺替换突变消除了Ca2位点中不利于稳定性的静电排斥作用所导致。结合上述Na+、Ca2+、Mg2+等金属离子影响pyrolysin性质的结果,我们认为海水中金属离子在调节pyrolysin的高温活性和热稳定性方面发挥重要作用。该结果还表明,对极端嗜热蛋白酶分子中的静电作用进行优化可以进一步提高极端嗜热蛋白酶的热稳定性和高温活性,这为进一步探索蛋白质／酶所能承受的极限温度范围及所采取的相应分子策略提供了新思路。最后,我们将来源于P. furiosus的S层蛋白(S1,PF1399)在大肠杆菌中成功表达,并针对重组S1蛋白对pyrolysin酶原的加工成熟过程及其成熟酶的性质的影响进行了研究。结果表明,S1蛋白可以通过提高pyrolysin酶原的折叠效率来提高pyrolysin的成熟效率。此外,在NaCl浓度相对较高的条件下,S1蛋白有利于pyrolysin成熟酶维持其热稳定性。因此,S1蛋白可能与天然pyrolysin在高温海水中加工成熟以及维持热稳定性相关。