康氏木霉纤维素酶基因(EGⅠ)的克隆与表达

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纤维素酶是天然纤维生物降解最主要的酶类。康氏木霉是一种常见产纤维素酶的微生物,但真菌的发酵周期较长,酶的产量和特性不易控制。因此,构建和利用基因工程菌作为大规模生产纤维素酶的一种途径。本论文利用大肠杆菌作为宿主菌克隆表达了康氏木霉纤维素酶基因(EGI)。 康氏木霉需要诱导才能产纤维素酶,而碳源是主要的诱导物。在扩增基因之前选择廉价的碳源(山梨糖,微晶纤维素、稻草细粉等)诱导培养康氏木霉,定时取样,测定内切葡聚糖酶酶活(CMC酶活)、外切葡聚糖酶酶活(P-NPC酶活)以及总酶活(滤纸酶活;FPA酶活),探讨不同碳源对康氏木霉产纤维素酶的诱导作用,为下一步分子克隆奠定基础。实验结果表明:以微晶纤维素为碳源诱导康氏木霉产纤维素酶酶活最高,第三天内切CMC酶活即达到17.58U/mL,外切P-NPC酶活达到11.39 U/mL,滤纸酶活达到1.68 U/mL。 以微晶纤维素为碳源诱导培养康氏木霉,提取总RNA,并以其为模板,利用RT-PCR扩增纤维素酶的cDNA,经琼脂糖凝胶电泳分析及测序验证后重组到T7启动子控制下的表达载体pET·His中,构建重组质粒;重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)plysS中,经IPTG(0.4mmol/L)诱导3h后,破胞提取菌体总蛋白,SDS-PAGE表明重组产物为一分子量约为45kDa的蛋白质,是与预期目的蛋白相一致的外源蛋白。 对重组酶的粗酶液进行了酶学性质的初步研究,表明:重组酶在pH5.0~7.0之间保持相对较稳定,以pH值为6.0时最稳定;重组酶在温度为30℃~40℃保温1h,酶活力保持在80%以上;结果表明Mn2+对重组酶EG Ⅰ活力均有明显的促进作用,而Cu2+等离子则对酶活力有一定程度的抑制作用,Mn2+浓度为2mmol/L时测得酶活力最大。
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