气管重建是气管外科学中的一个重要课题。目前，在因炎症、外伤、肿瘤或其它病变导致气管大范围受损，需要切除较长段气管的情况下，尚缺乏一个满意的方法用于修复缺损气管。近几年组织工程学的兴起和发展，使构建一种组织工程化气管作为气管移植材料成为可能。骨髓间充质干细胞(MSCs)是存在于骨髓内的一类成体干细胞，它具有很强的增殖能力和多向分化潜能，可以作为组织工程化气管的种子细胞来源。鉴于此，本实验首先体外分离培养鉴定MSCs，采用Trans-well技术建立体外MSCs与气管上皮细胞(RTE)共培养细胞体系，诱导MSCs向上皮细胞分化；随后在此共培养细胞体系，采用免疫组化、Westernblotting等技术研究Wnt/β-catenin信号通路参与MSCs向上皮细胞分化过程的调控机制；同时，运用蛋白抗体芯片技术检测RTE细胞分泌蛋白成分，以筛选特异性诱导MSCs向上皮细胞分化的细胞因子，为组织工程化气管的研究奠定实验基础。　　 第一部分体外诱导兔骨髓间充质干细胞向上皮细胞分化　　 一、目的　　 体外建立骨髓间充质干细胞与气管上皮细胞气液界面共培养体系，诱导骨髓间充质干细胞向上皮细胞分化。　　 二、方法　　 1、无菌分离兔股骨，DMEM培养基冲洗髓腔获得骨髓细胞悬液，采用差速贴壁分离的方法，纯化培养兔MSCs至80％融合，0.25％胰酶消化传代。　　 2、pMSCV/GF逆转录病毒转染AD-293包装细胞系，反复扩增3次，用TCID50(Tissue Culture Infection Dose50)法进行病毒滴度测定。随后pMSCV/GFP逆转录病毒转染第三代MSCs，荧光显微镜下观察转染效率。　　 3、无菌切取一段兔气管，采用两步酶消化法(Pronase酶和胰蛋白酶)对其进行消化，收集细胞悬液，贴壁培养纯化兔气管上皮细胞，并采用免疫荧光技术鉴定上皮细胞特异性标记cytokeratin18的表达。　　 4、建立气-液界面共培养细胞体系，将标记有GFP的MSCs和RTE以1:10比例混匀接种到套皿内，连续共培养14天，cytokeratin18免疫荧光染色鉴定MSCs分化结果。　　 三、结果　　 1、兔MSCs细胞呈长梭型，漩涡状排列，能够稳定传代至30代以上。　　 2、高滴度病毒原液转染3-6代MSCs48小时后，荧光显微镜下观察发现，约70-80％MSCs表达绿色荧光蛋白。　　 3、原代培养的兔RTE呈圆形、铺路石样生长。免疫荧光鉴定RTE表达cytokeratin18，纯度达95％以上。　　 4、气-液界面条件下，MSCs和RTE共培养14天后，荧光显微镜下观察，部分标记有GFP的MSCs表达了上皮细胞特异性角蛋白cytokeratin18，已具有了上皮细胞的一些特征。　　 四、结论　　 MSCs具有很强的增殖能力，体外能够稳定传代至30代，并维持稳定性状。体外通过建立MSCs与RTE气液界面共培养细胞体系，能够诱导MSCs向上皮细胞分化，证实骨髓间充质干细胞具有横向分化为上皮细胞的潜能，是理想的组织工程化气管种子细胞来源。　　 第二部分 Wnt/β-catenin信号通路对MSCs向上皮细胞分化的调控作用　　 一、目的　　 采用Trans-well技术，建立大鼠MSCs与RTE细胞共培养体系，成功诱导大鼠MSCs向呼吸道上皮细胞分化；在此细胞体系中，运用免疫荧光、Westernblotting等技术研究Wnt/β-catenin信号通路在MSCs向上皮细胞分化过程中的调控机制，寻找有效的途径提高MSCs向上皮细胞分化效率，为MSCs在组织工程化气管中的应用研究提供理论依据。　　 二、方法　　 1、差速贴壁分离法培养大鼠MSCs，选择稳定培养3-6代的MSCs，流式细胞仪技术鉴定MSCs表面标志CD45、CD90、CD79、CD34、CD44、CD29、CD73、CD11b、CD133的表达。　　 2、采用Trans-well技术，建立间接的大鼠MSCs与RTE细胞共培养体系，诱导MSCs向上皮细胞分化；分别共培养3、7、14天后，相差显微镜下观察MSCs形态学变化；采用免疫荧光、Western blotting技术检测MSCs中上皮特异性蛋白cytokeratin18，cytokeratin19，tight junctions protein occludin，cysticfibrosis transmembrane conductance regulator(CFTR)的表达水平。　　 3、在上述共培养细胞体系中，采用免疫荧光、Western blotting技术检测共培养0、3、7、14天时，MSCs中Wnt/β-catenin信号通路重要蛋白GSK-3β、β-catenin、TCF-3的蛋白表达水平及其磷酸化水平变化情况。　　 4、在上述共培养细胞体系中，分别加入20 mM LiCl，0.1μg/ml Wnt3α and20ng/ml DKK-1，采用CCK-8法检测各实验组MSCs增殖活力变化情况。　　 5、在上述共培养细胞体系中，分别加入20 mM LiCl，0.1μg/ml Wnt3α and20ng/ml DKK-1，激活或抑制Wnt/β-catenin信号通路，相差显微镜下观察MSCs上皮分化情况；随后采用免疫荧光、Western blotting技术检测此时MSCs中上皮细胞特异性蛋白cytokeratin18，cytokeratin19，tight junctions proteinoccludin，CFTR表达变化情况。　　 三、结果　　 1、大鼠MSCs聚集生长，呈长梭型，漩涡状排列。3-6代MSCs表达CD44、CD73、CD90、CD29(+)，不表达CD11b、CD34、CD45、CDl33(-)，符合骨髓间充质干细胞特征。　　 2、间接共培养体系中，RTE能够诱导部分MSCs出现由长梭型转变为多角形、圆形的形态改变，并且表达上皮特异性蛋白cytokeratin18，cytokeratin19，tightjunctions protein occludin，CFTR。　　 3、共培养3天时，MSCs中β-catenin、TCF-3表达升高，GSK-3β表达下调；共培养7、14天，与3天组相比较，MSCs中β-catenin、TCF-3表达开始下降，而GSK-3β表达上调。同时GSK-3β和β-catenin的磷酸化水平呈现与其蛋白表达相反的趋势。　　 4、在共培养细胞体系中，给予激活剂20 mM LiCl，CCK-8检测发现MSCs增殖活力升高；给予抑制剂20 ng/ml DKK-1，发现随时间延长MSCs增殖活力与control相比呈现下降趋势；给予0.1μg/ml Wnt3α，发现MSCs增殖活力与control相比都明显增高。　　 5、在共培养细胞体系中，给予20 mM LiCl瞬时激活MSCs内Wnt/β-catenin信号通路，能够抑制MSCs向上皮细胞分化；给予20 ng/ml DKK-1阻断MSCs内Wnt/β-catenin信号通路，能够促进MSCs向上皮细胞分化；给予0.1μg/mlWnt3α持续激活MSCs内Wnt/β-catenin信号通路，能够抑制MSCs向上皮细胞分化。　　 四、结论　　 体外培养的大鼠MSCs形态均一，增殖能力强，经流式细胞仪鉴定符合骨髓间充质干细胞特性。在共培养细胞体系中，RTE可以分泌大量细胞因子，诱导MSCs向上皮细胞分化。Wnt/β-catenin信号通路参与调控MSCs向上皮细胞分化和增殖过程。激活Wnt/β-catenin信号通路能够刺激MSCs增殖，抑制MSCs向上皮细胞分化；反之，阻断Wnt/β-catenin信号通路能够促进MSCs向上皮细胞分化。　　 第三部分 RTE细胞分泌液诱导MSCs向上皮细胞分化　　 一、目的　　 直接提取RTE细胞分泌液制备诱导培养基，观察其诱导MSCs向上皮细胞分化情况；采用蛋白抗体芯片技术分析RTE细胞分泌蛋白成份，筛选特异性的能够定向诱导MSCs向上皮细胞分化的细胞因子。　　 二、方法　　 1、用10％FBS的DMEM基础培养基，培养RTE细胞24小时，收集细胞上清液。将RTE细胞上清液与基础培养基按不同比例混合制备诱导条件培养基，选择3-6代MSCs进行诱导实验，相差显微镜下观察MSCs的形态学变化；采用免疫荧光、Western blotting技术检测MSCs中上皮特异性蛋白cytokeratin18，cytokeratin19，tight junctions protein occludin，CFTR的表达水平。　　 2、用无血清DMEM基础培养基，培养RTE细胞24小时，收集细胞上清液。用Millpore(3KD)超滤离心管浓缩该上清液，使其总蛋白含量达到5μg/μl。采用RayBio(R)Rat Cytokine Antibody Array蛋白抗体芯片技术，检测RTE细胞上清液中分泌蛋白的成份。根据蛋白芯片结果，采用ELISA试剂盒鉴定并检测RTE细胞分泌液中可能细胞因子浓度。　　 三、结果　　 1、RTE细胞上清液能够诱导MSCs发生形态学变化，细胞由长梭型向圆形、多边型转化；部分MSCs表达上皮特异性蛋白cytokeratin18，cytokeratin19，tightjunctions protein occludin，CFTR。　　 2、采用RayBio(R)Rat Cytokine Antibody Array蛋白抗体芯片技术检测RTE细胞分泌液，发现RTE细胞分泌32种细胞因子，其中FGF-BP、Growth Hormone、IFN-γ、TGF-β1、VEGF都与细胞转化调节有关，因此我们推测这些蛋白很可能是诱导MSCs向上皮细胞定向分化的关键因子。　　 四、结论　　 RTE细胞分泌液能够诱导MSCs向上皮细胞分化。RTE细胞能够分泌多达32种细胞因子，其中FGF-BP、Growth Hormone、IFN-γ、TGF-β1、VEGF都与细胞转化调节有关。这些蛋白可能与MSCs细胞膜受体结合，调控MSCs的分化方向，定向诱导MSCs向上皮细胞分化。