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目的： 原代培养并鉴定大鼠骨髓间充质干细胞（mesenchymalstemcells，MSCs）；构建携带谷氨酸脱羧酶65（glutamicaciddecarboxylase，GAD65）基因的慢病毒载体；将构建的GAD65基因慢病毒载体转染MSCs，检测转染后MSCs内GAD65的表达；将携带GAD65基因的MSCs通过侧脑室注射到大鼠癫痫模型脑内，观察脑内GAD65含量的变化及对大鼠癫痫发作的影响。 研究方法： 1、取4w雄性大鼠的胫骨、股骨，以含10％FBS的IMDM培养基反复冲洗骨髓腔，以贴壁法分离培养MSCs。显微镜观察细胞的形态，MTT法观察细胞增殖情况，流式细胞仪鉴定细胞表面标志。 2、设计合成GAD65引物，用PCR方法得到GAD65序列片段，GAD65克隆到慢病毒载体LV5中，重组质粒测序后抽提质粒，并进行慢病毒的包装与滴度测定。 3、用LV5-GFP-GAD65转染MSCs，计算转染率，通过嘌呤霉素筛选后扩大培养，得到稳定的转染株。通过RT-PCR、Westernblot检测MSCs中GAD65的表达情况。 4、大鼠隔日腹腔注射PTZ，按Racine癫痫发作分级标准评价动物发作级别，制作PTZ慢性癫痫模型。 5、将GAD65基因修饰的MSCs移植到癫痫大鼠模型侧脑室，鉴定其在脑内的表达及其对癫痫大鼠脑电图、行为学的影响。 结果： 1、大鼠MSCs分离成功，原代培养MSCs至第5d时可传代。细胞传代后2-3d可长至80%-90%融合。MTT比色法检测P3细胞显示细胞增殖迅速，增殖曲线呈“S”形。流式细胞仪检测P3细胞表面抗原，结果显示：表达MSCs表面标记物CD44、CD90，不表达造血干细胞等的表面标记物CD34、CD45。 2、LV5-GFP-GAD65质粒经酶切电泳结果显示扩增出大小为1758bp的GAD65基因片段，和大小为9337bp的LV5基因片段，测序结果与GAD65的序列完全一致。慢病毒经包装、浓缩后，得到滴度为5×107TU/mL的LV5-GFP-GAD65病毒液，滴度为7×107TU/mL的LV5病毒液。 3、用LV5-GFP-GAD65病毒液转染MSCs，转染72h后荧光显微镜下可以观察到明亮的绿色荧光，最佳感染复数（Multiplicityofinfection，MOI）为200，转染率为90%。RT-PCR检测转染后MSCs中GAD65mRNA的表达，与对照组、LV5-GFP转染组比较有明显的升高（P＜0.05）；Westernblot检测到GAD65的蛋白表达也较对照组明显升高（P＜0.05）。 4、大鼠在注射戊四氮后28d全部被点燃。 5、将GAD65-MSCs移植到癫痫大鼠模型侧脑室，GAD65-MSCs组冰冻切片中可以观察到移植细胞的荧光蛋白GFP表达，GAD65-MSCs移植组目的基因GAD65的蛋白表达高于对照组（P＜0.05），大鼠癫痫的发作次数和发作级别较对照组明显减低（P＜0.05），脑电图中癫痫的发作波幅较对照组减小（P＜0.05）。 结论： 1、本实验原代培养的MSCs增殖迅速，MSCs形态、表面标志性抗原符合MSCs的特点，可以用于细胞移植。 2、LV5-GFP-GAD65质粒构建成功，转染大鼠MSCs后，转染率高，能够过表达目的基因GAD65。 3、GAD65-MSCs移植到癫痫大鼠模型侧脑室后，移植细胞能够存活并发挥抑制癫痫发作的作用。