研究背景与意义：　　高通量测序技术的发展使大量非编码RNA（non-coding RNAs，ncRNAs）被发现。越来越多的功能研究证实ncRNAs可以参与调控染色质重塑、基因转录及转录后修饰、信号转导等生命过程，在机体正常发育及疾病发生发展过程中具有重要的调控作用。　　抗肿瘤免疫一直是肿瘤研究的热点领域，但在肿瘤环境下，T 细胞的功能往往受损而不能产生正常的免疫应答。微小RNAs（microRNAs，miRNAs）参与调控T细胞的生长及发育。在肿瘤环境下，T细胞中差异表达的miRNAs能参与调控T细胞活性及功能。深入研究肿瘤环境下miRNAs对T细胞的作用及调控机制，对于从ncRNAs角度进一步理解T细胞在肿瘤环境中功能失衡的原因具有积极意义。　　胃癌（gastric cancer，GC）是我国最常见的恶性肿瘤之一。胃癌转移是造成患者预后不良的主要原因，目前，胃癌转移的分子机制还远未阐明。在胃癌中，ncRNAs可以作为重要的促癌因子或抑癌因子。胃癌细胞中差异表达的miRNAs对于疾病的发生发展及预后有重要的调控及指示作用，但目前miRNAs对胃癌的调控机制尚未完全阐明。此外，新型环状非编码RNA（circular RNAs，circRNAs）在胃癌中也具有差异表达并表现出一定的功能，但目前大部分circRNAs在胃癌中的表达情况及功能尚不明确。综上，深入挖掘 miRNAs对胃癌转移的调控，同时关注新型环状非编码 RNAs， circRNAs在胃癌中的功能，对理解胃癌转移的分子机制，寻求新的治疗靶点具有重要意义。　　研究目的：　　1. 筛选肿瘤环境下CD8+T细胞中差异表达的miRNAs，并鉴定miR-491在CD8+T细胞中的功能及作用机制。　　2. 明确miR-491在胃癌细胞中的功能及对胃癌转移的调控机制。　　3. 筛选胃癌中差异表达的circRNAs，明确circ-TNPO3对胃癌转移的调控并探索其作用机制。　　研究方法：　　第一部分：miR-491靶向调控CDK4，TCF1和Bcl-xL抑制CD8+T细胞增殖，并促进细胞凋亡的作用及机制研究　　1. 构建C57BL/6小鼠结肠癌荷瘤模型，利用高通量芯片筛选脾脏CD8+T细胞中差异表达的miRNAs（筛选标准：倍数改变 ≥1.5，P＜0.05）；流式分选各CD8+T细胞亚群，qRT-PCR检测miR-491在各细胞亚群中的表达水平。　　2. 利用逆转录病毒系统，在T细胞中过表达miR-491后用流式细胞术检测细胞的增殖及凋亡情况。　　3. 采用ELISA试剂盒检测过表达miR-491后CD8+T细胞培养上清中IFN-γ的水平；PMA及离子霉素刺激CD8+T细胞后用流式细胞仪检测IFN-γ阳性的CD8+T细胞比例。　　4. 用TargetScan预测miR-491的靶基因，重点关注与细胞增殖、凋亡功能相关的基因；利用双荧光素酶实验鉴定miR-491的靶基因；通过qRT-PCR及western blot实验检测miR-491对靶基因表达水平的调控。　　5. 重组人 TGF-β1 刺激 CD8+ T 细胞及 Jurkat 细胞后，用 qRT-PCR 检测细胞内miR-491表达水平的变化；收集结肠癌细胞MC-38的条件培养基，单独或联合TGFβ阻断抗体作用于CD8+T细胞后，用qRT-PCR检测细胞内miR-491表达水平的变化。　　第二部分：miR-491通过调控SNAIL及FGFR4抑制胃癌转移的作用与机制研究　　1. qRT-PCR 检测 miR-491 在 40 对配对胃癌及癌旁组织中的表达水平；分析miR-491表达水平与临床资料的相关性。　　2. 体外功能实验评价miR-491对胃癌细胞、血管内皮细胞表型的影响：在细胞中转染miR-491 mimics或mimic NC后，用CCK8实验检测细胞增殖情况；流式细胞术检测细胞凋亡情况；Transwell实验检测细胞转移能力。　　3. 体内功能实验评价miR-491对胃癌生长及转移的影响：采用逆转录病毒系统构建 miR-491过表达稳转株（SGC-7901），利用裸鼠移植瘤模型，腹腔播散模型，肺远端转移模型评价miR-491在体内对胃癌生长及转移的影响。　　4. 联合生物信息学、高通量芯片筛选胃癌中差异上调的基因，预测胃癌中miR-491的靶基因；通过双荧光素酶实验鉴定miR-491的靶基因；通过qRT-PCR及western blot检测miR-491对靶基因表达水平的影响。　　5. qRT-PCR检测SNAIL及FGFR4在40对配对胃癌及癌旁组织中的相对表达水平；分析SNAIL、FGFR4及miR-491三者间表达水平的相关性；绘制KM-plot曲线分析SNAIL及FGFR4表达水平与胃癌病人预后的相关性。　　6. 评价 SNAIL及 FGFR4对胃癌细胞表型的影响：在体外，单独转染 si-SNAIL, si-FGFR4, pCMV-SNAIL或共转染miR-491 mimics后，分别利用CCK8实验、Transwell实验检测细胞增殖及转移能力；在体内，用免疫组化、western blot等评价过表达miR-491对SNAIL及FGFR4表达水平的影响。　　第三部分：新型环状非编码RNA：circ-TNPO3抑制胃癌转移的作用及机制研究　　1. 选取5对配对胃癌及癌旁组织，利用高通量芯片筛选差异表达的circRNAs（筛选标准：倍数改变 ≥1.5，P＜0.05）。　　2.鉴定circ-TNPO3是否成环：Rnase R消化总RNA或OligdT引物逆转录或放线菌素处理细胞后用qRT-PCR检测circ-TNPO3的表达；Sanger测序鉴定PCR产物是否跨circ-TNPO3剪接接口；以gDNA为模板检测是否能扩增circ-TNPO3。　　3. circ-TNPO3原位杂交检测其在胃癌细胞及组织中的定位；核质分离PCR实验检测circ-TNPO3在细胞核、细胞质中的表达水平。　　4. qRT-PCR检测circ-TNPO3及其亲本基因linear-TNPO3在59对配对胃癌及癌旁组织中的表达水平，并分析二者表达水平的相关性；原位杂交检测circ-TNPO3在100例胃癌组织及80例癌旁组织中的表达水平，采用双盲法对原位杂交结果进行评分，并与临床资料进行相关性分析。　　5. 在体外针对 circ-TNPO3 剪接接口设计 siRNA 并干扰 circ-TNPO3 表达后，用Transwell实验检测各胃癌细胞系转移能力的变化；qRT-PCR，western blot及免疫荧光等实验检测干扰circ-TNPO3后对SNAIL表达水平的影响。　　6. 利用慢病毒系统构建稳定干扰circ-TNPO3的胃癌细胞株（SGC-7901）。在体内，利用裸鼠移植瘤模型，腹腔播散模型及肺远端转移模型评价circ-TNPO3对胃癌生长及转移的影响。　　7. RIP 实验检测 circ-TNPO3 是否与 AGO2 蛋白相结合；双荧光素酶实验检测circ-TNPO3是否与miRNAs相结合；RNA pull down实验联合qRT-PCR检测circ-TNPO3与miRNAs的相互作用；RNA pull down实验联合SDS-PAGE电泳及蛋白质质谱检测circ-TNPO3与蛋白质的相互作用。　　研究结果:　　第一部分：miR-491靶向调控CDK4，TCF1和Bcl-xL抑制CD8+T细胞增殖，并促进细胞凋亡的作用及机制研究结果　　1. 经高通量芯片筛选，发现数个miRNAs在肿瘤来源的CD8+ T细胞（实验组）中的表达水平较对照组细胞有显著差异，其中，miR-491在实验组总CD8+T细胞中的表达水平较对照细胞显著升高（P＜0.05）；对不同CD8+T细胞亚群分析后发现miR-491在效应性CD8+T细胞中升高最显著（P＜0.05），在初始CD8+T细胞及中心记忆性CD8+T细胞中表达有升高的趋势但无统计学差异。　　2. CD4+T细胞及CD8+T细胞经逆转录病毒感染并过表达miR-491后，经流式检测发现过表达miR-491能显著抑制CD4+T细胞及CD8+T细胞的增殖，并且显著促进CD4+T细胞及CD8+T细胞的凋亡。　　3. ELISA结果显示，过表达miR-491组CD8+ T细胞培养上清中的IFN-γ水平显著低于对照组（P＜0.01）；内因子染色后流式分析结果显示过表达miR-491组CD8+T细胞中IFN-γ分泌水平较对照组显著下降（P＜0.01）。　　4. 除文献报道过Bcl-xL为miR-491的靶基因外，双荧光素酶实验新鉴定CDK4， TCF1为miR-491的靶基因；过表达miR-491组CD8+T细胞中Bcl-xL，CDK4及TCF1的mRNA及蛋白水平均显著下降。上述结果提示，在CD8+T细胞中，Bcl-xL，CDK4及TCF1为miR-491的靶基因。　　5. qRT-PCR实验结果显示，在培养基中加入重组人TGF-β1（10ng/mL）后，CD8+T细胞及Jurkat细胞中miR-491的表达水平在24 h及48 h均显著上调；按1∶5以上比例稀释的MC-38条件培养基作用于CD8+T细胞24 h后，miR-491的表达水平显著上调；当在MC-38条件培养基中加入TGFβ阻断抗体后，条件培养基无法诱导miR-491表达上调。上述结果提示肿瘤细胞来源的TGFβ可以诱导CD8+T细胞中miR-491的表达。　　第二部分：miR-491通过调控SNAIL及FGFR4抑制胃癌转移的作用与机制研究结果　　1. qRT-PCR结果显示miR-491的表达水平在40例胃癌组织中较配对癌旁组织显著下调（P＜0.001），并且与肿瘤体积大小及病理分型显著相关（P＜0.05）。　　2. CCK8实验显示过表达miR-491组的胃癌细胞、血管内皮细胞的增殖能力显著低于对照组；流式细胞术实验显示过表达miR-491组发生凋亡的胃癌细胞数较对照组显著增加；Transwell实验显示过表达miR-491组胃癌细胞、血管内皮细胞的转移能力显著低于对照组。上述结果均有统计学差异（P＜0.05）。　　3. 裸鼠移植瘤模型结果显示过表达 miR-491 组肿瘤体积显著小于对照组（P＜0.01）；腹腔播散模型结果显示过表达miR-491组小鼠腹腔内肿瘤结节数量显著少于对照组（P＜0.01）；肺远端转移模型结果显示过表达miR-491组小鼠肺部肿瘤转移结节数量显著少于对照组（P＜0.01）。上述结果表明，miR-491在体内能显著抑制胃癌的生长及转移。　　4. 双荧光素酶实验证实miR-491能与SNAIL-3′-UTR结合，不能与FGFR4-3′-UTR结合；过表达miR-491显著抑制胃癌细胞中SNAIL及FGFR4的mRNA及蛋白水平。上述结果提示miR-491直接靶向抑制SNAIL，间接抑制FGFR4的表达。　　5. qRT-PCR结果显示SNAIL及FGFR4的表达水平在40例胃癌组织中较配对癌旁组织显著上调（P＜0.01）；相关性分析发现在40例胃癌组织中，SNAIL与miR-491表达水平呈负相关（P＜0.05），FGFR4与miR-491表达水平不相关（P=0.256），SNAIL与FGFR4表达水平呈正相关（P＜0.001）；生存分析结果提示SNAIL及FGFR4表达水平升高与病人的预后较差显著相关（P＜0.001）。上述结果提示SNAIL与FGFR4在胃癌中可能具有促癌的作用。　　6. 在SGC-7901细胞中，干扰SNAIL或FGFR4后，细胞的增殖和转移能力较对照组显著下降，与过表达miR-491表型一致；过表达SNAIL后，细胞的增殖和转移能力较对照组显著升高；在过表达 miR-491 的基础上恢复 SNAIL 的表达，能部分回复miR-491的抑癌表型，提示SNAIL介导了miR-491在胃癌中抑制胃癌细胞增殖和转移的功能；在小鼠荷瘤结节及腹腔播散肿瘤结节中，miR-491过表达组中SNAIL及FGFR4的蛋白水平显著下降，证实了miR-491在体内对SNAIL及FGFR4的调控。　　第三部分：新型环状非编码RNA：circ-TNPO3抑制胃癌转移的作用及机制研究　　1. 芯片结果显示胃癌中存在大量差异表达的circRNAs；经qRT-PCR筛选，鉴定出circ-TNPO3在胃癌组织中较癌旁组织显著下调。　　2.qRT-PCR结果显示circ-TNPO3耐Rnase R消化，无法被oligodT引物逆转录，在细胞内半衰期长于linear-TNPO3；Sanger测序证实PCR产物跨circ-TNPO3剪接接口；原位杂交及核质分离PCR实验显示circ-TNPO3主要定位于胃癌细胞及胃组织上皮细胞的细胞质中。上述结果提示，circ-TNPO3稳定存在于胃癌细胞及组织中，并具有环状RNA的一般性质。　　3. qRT-PCR实验结果显示circ-TNPO3及其亲本基因linear-TNPO3在59例胃癌组织中较配对癌旁组织显著下调（P<0.001）。相关性分析发现在正常组织中，circ-TNPO3与linear-TNPO3的表达水平呈显著正相关（R2=0.5812，P＜0.001）；在肿瘤组织中，二者表达水平仍然呈正相关，但相关系数较正常组织中低（R2= 0.0104，P ＜0.05）。利用胃癌FFPE标本进行circ-TNPO3原位杂交，结果显示circ-TNPO3在胃癌组织中表达下降，并且与胃癌的TNM分期相关。　　4. 体外利用siRNA干扰胃癌细胞中circ-TNPO3表达后，Transwell实验结果显示，干扰circ-TNPO3后细胞转移能力较对照组显著增强；qRT-PCR，western blot及免疫荧光等实验结果显示干扰circ-TNPO3后胃癌细胞内SNAIL的表达水平较对照组显著升高。上述结果提示circ-TNPO3可能参与调控EMT进而抑制胃癌细胞转移。　　5. 裸鼠移植瘤模型结果显示干扰circ-TNPO3组小鼠肿瘤体积显著大于对照组（P＜0.05）；腹腔播散模型结果显示干扰 circ-TNPO3 组小鼠腹腔内的肿瘤结节数量显著多于对照组（P＜0.001）；肺远端转移模型结果显示干扰circ-TNPO3组小鼠肺部肿瘤转移结节数量显著多于对照组（P＜0.05）。上述结果表明，circ-TNPO3在体内具有显著抑制胃癌生长及转移的作用。　　6. RIP实验结果显示circ-TNPO3可以与AGO2蛋白相结合；双荧光素酶实验联合circ-TNPO3 RNA pull down实验发现circ-TNPO3可以与数个miRNAs相结合，但结合能力较弱；circ-TNPO3 RNA pull down联合质谱分析结果显示circ-TNPO3可以与蛋白质相结合，这些蛋白质主要参与核糖体、剪切体的组装，细胞内糖代谢、抗原递呈及RNA降解等过程。上述结果提示circ-TNPO3有可能通过与miRNAs或蛋白质相结合，发挥抑制胃癌转移的作用。　　研究结论：　　第一部分：miR-491靶向调控CDK4，TCF1和Bcl-xL抑制CD8+T细胞增殖，并促进细胞凋亡的作用及机制研究　　本研究首次揭示了miR-491对肿瘤环境下CD8+ T细胞功能及机制的影响。肿瘤来源的 TGFβ 促进 CD8+ T 细胞中 miR-491 表达水平升高。miR-491 通过靶向抑制CDK4，TCF1和Bcl-xL，导致CD8+ T细胞增殖受限，凋亡亢进及IFN-γ分泌减少。本研究提示miR-491有可能作为抗肿瘤免疫治疗的潜在靶点。　　第二部分：miR-491通过调控SNAIL及FGFR4抑制胃癌生长及转移的作用与机制研究　　本研究首次阐明了miR-491抑制胃癌转移的功能及机制。miR-491在体内外均能显著抑制胃癌转移。主要机制为：一方面，miR-491直接靶向SNAIL进而抑制胃癌的EMT进程；另一方面，miR-491间接作用于FGFR4，进一步导致SNAIL的下降。通过上述两方面的机制miR-491最终抑制胃癌的转移。本研究首次证实miR-491是胃癌转移的负调控因子，提示其可以作为胃癌转移治疗的潜在靶点。　　第三部分：新型环状非编码RNA：circ-TNPO3抑制胃癌转移的作用及机制研究　　本研究系统筛选了胃癌中差异表达的 circRNAs，并首次阐释了 circ-TNPO3 在胃癌转移中的作用及可能的机制。circ-TNPO3 在胃癌中显著低表达。体内外实验证实circ-TNPO3能显著抑制胃癌转移。分子水平上，circ-TNPO3能显著抑制SNAIL的表达，提示circ-TNPO3有可能参与调控EMT进而抑制胃癌转移。我们探究了两方面可能的机制，一是circ-TNPO3通过miRNAs海绵的方式，与数个促癌miRNAs相结合；另一方面，circ-TNPO3 可以直接与蛋白质相结合发挥调控功能。本研究为 circRNAs在胃癌中具有调控作用提供了新的实验证据，提示circ-TNPO3有可能作为胃癌转移治疗的潜在靶点。