拟南芥激活标签突变体库的构建及盐敏感突变体的筛选

来源 :黑龙江八一农垦大学 | 被引量 : 1次 | 上传用户:vs1ji
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植物的生长发育与其所处的环境有着密切关系,在各种环境因素中,非生物逆境对植物的影响尤为重要。主要包括高盐、干旱、涝害、低温和高温等对植物的影响,这些也是导致农作物产量减少的主要环境因素。因此,研究植物对非生物胁迫的适应机制不仅有着重要的理论意义,而且还具有可观的经济价值。激活标签技术是一项基于基因过表达的突变体库构建技术,对于性状不易检测的基因及具有功能冗余的家族基因的功能研究具有独特优势。因此,利用激活标签技术构建模式植物拟南芥突变体库,从中筛选逆境相关的突变体,分离、研究相关基因的功能具有良好的应用前景。本试验以拟南芥(Arabidopsis thaliana)为材料,利用激活标签技术,构建了拟南芥的功能获得型突变体库,从中筛选盐敏感突变体,通过Tail-PCR方法克隆基因并进行基因的功能初步研究,取得的主要结果如下:(1)本试验运用激活标签技术,以Columbia(col)野生型为实验材料,以双元载体pCB260为转化载体,利用浸花法大规模转化col野生型植株,经Basta除草剂抗性筛选构建激活标签突变体库。目前已筛选具有Basta抗性的T1代突变体约10,000株。(2)筛选T1代Basta抗性植株过程中,观察并筛选到部分表型缺陷突变体。缺陷表型主要涉及花期改变、株型变异、叶形特异、育性降低、花器官发育异常、种子颜色改变等特征。选取其中10株利用Tail-PCR方法已分离到T-DNA的侧翼序列。(3)利用75mM NaCl作为筛选盐敏感突变体的标准浓度,从本试验所构建的激活标签突变体库中筛选盐敏感突变体。目前已筛选到三株盐敏感植株:1985、1742、2012。利用Tail-PCR方法分离到T-DNA的侧翼序列,用三引物法对T-DNA位点进行了验证,并鉴定到纯合体。半定量RT-PCR方法检测了三株突变体T-DNA侧翼序列的表达水平变化,发现1985属于过表达突变,而1742和2012则属于敲除突变。利用激光共聚焦技术检测三个突变体经过盐胁迫前后体内H2O2、NO水平变化,初步认为这三个突变体参与H2O2和NO介导的盐信号途径。通过western blotting检测经盐胁迫处理前后1985突变体内ABA合成酶的含量变化,初步确定AT1985是ABA信号途径的上游作用元件。
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