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骨骼肌纤维类型组成与肉品质密切相关。出生后肌纤维类型及其转化的营养调控依赖于卫星细胞的定向分化。卫星细胞以表达生肌调控因子Pax3/Pax7为特性,其表达差异导致不同生肌命运。研究发现维生素D3可促进快肌纤维形成,但其分子机制尚不清楚。本研究假设Pax3/Pax7在卫星细胞定向分化成不同类型肌纤维中起着决定性作用,维生素D3促进快肌生成与调节Pax3/Pax7表达有关。本研究利用相关分子细胞生物技术、基因敲除小鼠及维生素D3营养模型小鼠,探明Pax3/Pax7在肌纤维发育中的决定机制及VD3的调节作用与信号途径,为深入认识肌纤维发育规律及建立营养调控技术奠定理论基础。本论文设计4个试验,并通过系统的研究获得以下结果:试验一,Pax3+和Pax7+骨骼肌卫星细胞群的增殖、分化特性研究本试验以流式细胞术分选的C57BL/6小鼠卫星细胞为材料,利用免疫荧光、Western Blotting分析Pax3+与Pax7+卫星细胞群之间增殖及分化差异。结果显示:Pax3+卫星细胞维持更长时间的自我更新和增殖能力,Pax7+卫星细胞更倾向分化。诱导分化后观察到,Pax3+卫星细胞分化成有节律性收缩的肌管,以表达慢肌为主;Pax7+卫星细胞分化成短暂快速收缩肌管,以表达快肌为主。结论:Pax3使细胞维持更长的干性、调节慢肌生成:Pax7调节快肌生成。试验二,Zac1/GPR39磷酸化CaMK-Ⅱ决定Pax3和Pax7在生肌过程中的不同作用本试验在小鼠C2C12成肌细胞中采用基因重组技术,CoIP免疫共沉淀鉴定Pax3和Pax7靶蛋白,通过细胞体内移植和步态分析,探讨Pax3/Pax7在肌细胞增殖及定向分化成不同肌纤维类型的作用及分子机制。结果显示:在C2C12中过表达Pax3 或 Pax7,发现 Zacl 和 GPR39 都被 Pax7 上调,而 Pax3 不诱导 Zac1 和 GPR39表达。CoIP证实Zac1直接与Pax7相互作用;Pax7调控GPR39表达是通过激活Zac1来实现的。在Pax7 RV转染的C2C12中沉默Zac1后发现,Zac1/GPR39系统可以促进分化并且以生成快肌纤维为主。步态分析显示,将Pax7RV/siZac1转染的细胞移植到心脏毒素(CTX)损伤后的mdx小鼠中,会延迟肌肉功能修复;二次损伤后,该细胞表现为能够维持更长时间的再生能力。分子机制研究结果证明,Zac1/GPR39系统与Pax3和Pax7的不同生肌功能有关:Pax7可以激活Zac1/GPR39系统,使得CaMK-Ⅱ磷酸化并通过抑制β-catenin表达和p-ERK1/2去磷酸化促进快肌纤维形成;缺乏Zac1/GPR39系统的细胞倾向于保留干性,诱导分化后形慢肌纤维。结论:Pax7激活Zac1/GPR39系统表达,通过CaMK-Ⅱ的磷酸化抑制β-catenin促进快肌纤维形成。试验三,Pcbp1调节肌细胞分化及肌纤维类型的信号途径研究发现,Pcbp1能够加工miRNA成熟调控Pax3/Pax7表达,但是其生物学功能及加工信号途径尚未确定。本试验构建Pcbp1f/f敲除小鼠模型,qPCR检测相关miRNA及Pax3/Pax7表达,免疫荧光染色观察MyHC-Ⅰ和MyHC-Ⅱ变化:在C2C12中加入 siPcbp1 后,Northern Blotting 检测 miR1、miR133、miR206,CoIP 鉴定 miRNA加工成熟的组分与Pcbp1相互作用,探索Pcbp1参与miRNA成熟过程的新功能、调节骨骼肌发育及其肌细胞增殖、分化的分子机制。结果显示:Pcbp1直接与Ago2和其他miRNA途径组分相互作用调节肌肉特异性miR-1、miR-133和miR-206的加工。表现出Pcbp1f/f小鼠早期胚胎致死率增加,表明Pcbp1对动物发育必不可少。Pcbp1f/f小鼠肌纤维上卫星细胞数量减少,Pax3表达降低而Pax7表达上调,表现为肌肉生长缺陷和快肌增多。体内检测miR-1、miR-133和miR-206表达也降低,但是调节肌纤维类型相关的miR208无统计学差异。结论:Pcbp1不是通过miRNA直接调节肌纤维类型,可能是通过上调Pax7的表达,促进快肌生成。试验四,维生素D3对肌纤维类型的调节作用及其信号通路本试验的目的是探索维生素D3缺乏引起的快肌纤维萎缩和比例下降与Pax3/Pax7卫星细胞含量的关系。试验建立避光饲养不含维生素D饲料的缺乏维生素D3模型小鼠(VD3-)及尾静脉注射1α,25(OH)2D3模型小鼠(VD3+),利用放射免疫检测甲状腺激素水平;体内电穿孔过表达GPR39,Western Blotting检测shh信号途径相关蛋白表达:CTX损伤肌肉后HE染色、免疫荧光染色鉴定模型小鼠再生能力;qPCR及Western Blotting检测Pcbp1、Pax3/Pax7和调控肌纤维类型相关基因的表达,探索维生素D3对肌纤维类型的调节作用及其信号通路。结果显示:放射免疫检测发现维生素D3上调甲状腺激素T3浓度,甲状腺激素T4无统计学差异。Western Blotting检测发现维生素D3促进GPR39表达上调,shh信号通路中Gli2和DI03蛋白表达降低;在VD3-小鼠趾长伸肌(TA)中电穿孔过表达GPR39发现,Gli2和DI03表达升高。甲减Hypo-组和VD3+/Hypo-组与对照组相比,单根肌纤维上卫星细胞含量减少,损伤后修复延迟;Western Blotting检测发现,Pcbp1蛋白表达显著升高;同时,qPCR结果观察到Pax3和调节慢肌蛋白相关基因(MYH7、Tnni1和Myoglobin)表达显著增加,而Pax7及调控快肌蛋白表达的MYH基因(MYH1和MYH2)表达结果则相反。结论:维生素D3通过阻断shh信号途径,上调甲状腺激素T3浓度,导致Pcbp1降低而增加Pax7表达,促进向快肌分化。综上所述,本研究表明,Pax3与Pax7卫星细胞具有不同的增殖、分化特性,Pax3+卫星细胞维持更长时间自我更新和增殖能力,分化后以表达慢肌为主,而Pax7+卫星细胞更倾向分化,分化后以表达快肌为主;Pax7可激活Zac1/GPR39系统,促使CaMK-Ⅱ的磷酸化,抑制细胞核内β-catenin,促进快肌纤维形成;维生素D3可促进快肌生成,其机制是阻断shh信号途径,促进T3分泌,抑制Pcbp1的表达,增加Pax7表达。