霍乱弧菌是引起人类传染病霍乱的病原,可引起宿主急性肠道感染、水样腹泻、呕吐、导致严重脱水甚至死亡,目前在卫生环境条件较差的地区仍时有爆发。研究发现,霍乱弧菌在水生环境中通常以生物被膜的形式与浮游生物共生,而当霍乱弧菌进入动物或人体后,将重新调整毒力因子的表达以适应宿主肠道环境,进而在肠上皮细胞进行定殖并分泌毒素。存在于霍乱弧菌周质空间的二硫键氧化还原蛋白(Disulfide bond oxidoreductase,DsbA),可通过氧化还原反应把自身的二硫键转移给底物蛋白,从而使底物蛋白具有正确构象进而发挥作用。研究发现,VcdsbA缺失株不能在乳鼠肠道内定殖,霍乱弧菌的霍乱毒素也被证明为VcDsbA蛋白的催化底物。然而VcDsbA能与哪些蛋白质相互作用进而调节霍乱弧菌的生命代谢,VcDsbA又是如何调控霍乱弧菌体内毒力因子的表达,以及对于霍乱弧菌在体外水生环境中的生存又起到什么样的作用,尚不清楚。本研究通过捕获VcDsbA的底物蛋白和构建霍乱弧菌VcdsbA缺失株,来研究VcDsbA在霍乱弧菌体外生物被膜的形成和体内霍乱毒素的调控中的作用。将VcDsbA活性中心的第33位半胱氨酸进行定点突变,并通过亲和层析捕获VcDsbA可能作用的底物,有40多个底物蛋白被捕获到,包括外膜蛋白(outer membrane protein,OMP)、菌毛合成相关蛋白、分子伴侣及转录调控因子等;采用同源重组和基因克隆的方法对霍乱弧菌dsbA(vc0034)基因进行敲除和回补;通过结晶紫染色实验发现,与野生型(WT)相比,dsbA基因缺失突变株(ΔdsbA)生物被膜形成能力显著下降;用荧光素酶基因作为报告基因和FLAG融合表达分析与生物被膜形成相关的甘露糖敏感血凝素纤毛合成蛋白(MSHA)在霍乱弧菌WT、ΔdsbA和回补菌株(CΔdsbA)中表达水平的区别,发现ΔdsbA菌株中msh基因转录水平和蛋白表达水平明显降低;通过MSHA血凝实验发现,ΔdsbA不能引起绵羊红细胞凝集;以上研究说明VcDsbA通过增强MSHA的表达来促进生物被膜的形成。以荧光素酶基因作为报告基因,检测ΔdsbA霍乱毒力基因的表达,发现霍乱弧菌的关键毒力基因表达调控蛋白ToxT的表达量在dsbA基因缺失突变株中显著低于野生型;利用细菌双杂交实验分析TcpP二聚体形成情况,结果表明TcpP在没有DsbA存在的条件下,不能形成二聚体,推测DsbA可以通过氧化TcpP周质空间结构域的半胱氨酸残基,使其形成二硫键从而促进TcpP二聚体的形成;AMS底物分析发现TcpP周质空间结构域的半胱氨酸残基确实是VcDsbA的底物。这些结果说明霍乱弧菌利用VcDsbA催化氧化TcpP形成二聚体,从而激活下游毒力因子toxT表达。综上所述,霍乱弧菌在体外水生环境中,VcDsbA可能通过影响其它调控因子直接或间接增强霍乱弧菌MSHA的生物合成,从而促进霍乱弧菌生物被膜的形成。在体内的宿主小肠环境中,VcDsbA通过协助毒力基因表达调控蛋白TcpP形成具有诱导活性的二聚体形式,从而激活霍乱弧菌毒力基因的表达,使得霍乱弧菌在肠道环境中成功定殖并致病。本论文的研究结果为研究霍乱弧菌DsbA蛋白在毒力基因的表达调控以及生物被膜形成的分子作用机制中的作用奠定了基础,也为进一步阐明霍乱弧菌的致病机制提供了重要的理论依据。