随着化石燃料燃烧使用而导致的日益加重的环境污染,人们对环境友好型清洁能源的需求越来越迫切。来源于植物的木质纤维素是一种含量丰富的清洁可再生资源,由其转化而来的生物燃料能部分替代人们对化石燃料的需求,减少环境污染性气体的排放,符合可持续发展。纤维素酶能够高效降解生物质产生可溶性的还原糖。因此,如何高效并且大量地获得纤维素酶成为降低生物燃料生产成本的关键步骤。一直以来,丝状真菌被广泛应用于工业生产各种纤维素酶类,其中的典型代表是里氏木霉(Trichodermareesei)。当不溶性的纤维素、半纤维素及植物生物质存在时,里氏木霉能快速产生大量纤维素酶,降解生物质产生多种可溶性寡糖。同时,里氏木霉纤维素酶表达受到碳源代谢阻遏(carbon catabolite repression,CCR)抑制。当葡萄糖存在时,里氏木霉会优先利用葡萄糖,不产纤维素酶。虽然目前里氏木霉纤维素酶的诱导表达机制得到了比较深入的研究,但是作为纤维素酶表达调控重要组成部分的碳源代谢阻遏机制研究却相对较少。Cre1是里氏木霉中介导碳源代谢阻遏的主要转录调控因子,将其敲除可以部分解除本底水平和诱导水平的碳代谢阻遏。但是转录因子Cre1发挥作用的分子机制是什么?其细胞定位及其与启动子的结合在纤维素酶表达调控过程中的作用是什么?是否有其他的辅阻遏因子参与里氏木霉碳源代谢阻遏过程?这些问题都有待进一步研究。因此本文中我们对里氏木霉的碳源代谢阻遏机制进行了详细探究,期望更加全面的解析里氏木霉纤维素酶的表达调控机制。基于以上的背景,我们主要进行了以下四个方面的工作:1、对里氏木霉cre1进行敲除及过表达以研究其生物学功能Cre1是可与DNA结合的C2H2型锌指蛋白,它是已知的在里氏木霉碳源代谢阻遏中发挥关键作用的转录因子。我们通过同源双交换的手段构建了里氏木霉cre1缺失菌株△cre1,并通过启动子置换构建了 cre1过表达菌株Ptcu-cre1。我们对cre1缺失及过表达菌株进行了表型分析,发现△cre1在多种碳源上的平板生长都弱于野生型,菌落边缘不整齐,生孢困难,但是其菌丝形态及在液体摇瓶培养下的生长并没有发生缺陷。cre1过表达菌株的平板生长及菌丝形态都正常,但是其纤维素酶诱导表达却发生缺陷。2、分析了△cre1在不同碳源上纤维素酶基因的转录情况,证明cre1对纤维素酶基因的快速转录起始和关闭是必需的。之前有文献报道Cre1在纤维素酶本底表达和诱导表达过程中都发挥抑制作用,但是其在纤维素酶诱导起始和关闭过程中的作用尚未有研究报道。我们进一步分析了 cre1基因缺失对纤维素酶基因转录起始和关闭的影响,结果显示cre1缺失影响了纤维素酶基因的快速转录起始,且cre1缺失后纤维素酶基因转录关闭变慢。我们的结果说明纤维素酶基因转录起始与关闭都需要Cre1。3、研究了 Cre1在不同碳源下的胞内定位,以及Cre1与cbh1启动子结合对cbh1转录的影响。为了进一步研究Cre1在纤维素酶基因表达调控过程中的作用机制,我们研究了 Cre1的细胞定位以及其与启动子的结合对纤维素酶基因转录的影响。首先我们构建了 Cre1蛋白N端加GFP标签的菌株,发现不论在抑制碳源还是诱导碳源下Cre1都有核聚集现象。然后我们将cbh1启动子上三个主要的Cre1结合位点突变,并研究了突变体的纤维素酶基因转录情况。结果显示Cre1结合位点突变后,cbh1的转录提前,与△cre1表型不一致。这些结果说明cre1缺失造成的纤维素酶基因转录延迟是一种间接的影响。4、鉴定了在里氏木霉纤维素酶表达调控过程中发挥重要作用的辅因子Trtc1蛋白,并对其功能进行了分析。在酿酒酵母中,Mig1p(Cre1同源蛋白)的抑制功能主要由辅阻遏因子Tup1p介导。我们通过序列比对鉴定了里氏木霉中Tup1p蛋白的同源蛋白Trtc1(Tup1-related transcriptional cofactor 1),并对其功能进行了深入研究。我们首先通过双交换的手段将trtc1自身启动子置换为受铜离子调控的启动子,通过添加铜离子调控trtc1的转录。我们发现trtc1缺失会造成纤维素酶诱导表达缺陷,这种缺陷发生在转录水平上。而trtc1过表达会提升纤维素酶表达水平。这些结果说明Trtc1对纤维素酶诱导表达是必需的。