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产气荚膜梭菌α毒素(Clostridium perfringens alpha-toxin,CPA)是引起人类食物中毒和气性坏疽的主要致病外毒素,广泛的存在于自然界中。近年来,出现了越来越多由产气荚膜梭菌引起的食物中毒事件,而且其主要的致病因子是CPA,人们开始从各个方面研究CPA的性质,主要有CPA的结构、N端和C端的功能以及基因融合表达等,但对CPA引起食物中毒后的急性救治与治疗性抗体,目前并没有深入的研究。本研究利用基因工程手段,将CPA全基因序列的两端插入Nde I和EcoR I酶切位点,构建重组表达质粒pET-28a-CPA,制备感受态E.coli BL21(DE3)细胞,获得表达菌E.coli BL21(DE3)(pET-28a-CPA),对诱导表达条件进行优化,摸索纯化工艺获得最佳纯化条件,最终得到纯度高的CPA纯品。以CPA为抗原,通过Tomlinson I+J全人源噬菌体抗体库,筛选人源抗CPA-scFv,单链抗体经诱导表达以及纯化后测定单链抗体的免疫结合活性、生物学活性和亲和常数。重组表达质粒pET-28a-CPA,经双酶切鉴定正确后,经测序得出结果显示:CPA全基因以正确的阅读框架克隆入pET-28a载体中,表达的重组蛋白相对分子质量约为43000 Da。对表达条件和纯化工艺进行优化后,CPA主要以可溶性形式表达,最佳诱导条件为:TB培养基,诱导温度为37℃,诱导时间为3 h;最佳纯化工艺为:样品经30%-50%饱和度硫酸铵沉淀—疏水层析(Butyl Sepharose 4 FF)—金属螯合层析(Cu2+)—阴离子交换层析(DEAE)—酶切后的经金属螯合层析(Cu2+),获得纯度为95.53%的CPA,浓度为0.663 mg/mL,蛋白回收率为5 mg/g湿菌。通过四轮筛选后,鉴定得到两株阳性克隆scFv-7D和scFv-8B,经DNA测序和Blast数据库分析后均为人源单链抗体。获得的阳性菌株诱导表达,经过60%饱和度硫酸铵沉淀—rProtein-A FF亲和层析后,能够获得的纯度在90%以上的单链抗体;生物活性试验结果显示:scFv-8B和scFv-7D都具有良好的抑制CPA活性的作用;通过间接法ELISA测定免疫结合活性,得出scFv-8B的免疫结合活性高于scFv-7D,且scFv免疫结合活性强度与scFv的浓度呈正向相关;测定scFv亲和常数:scFv-7D为(2.01±0.78)×108 L/mol,scFv-8B为(3.45±0.58)×108 L/mol。在本研究中,CPA在大肠杆菌中以可溶形式表达,在以特定纯化工艺后,获得纯度较高的CPA,操作简便,且回收率高,为蛋白纯化开辟了一条新的途径,也对进一步研究C PA在食物中毒中的致病机制和生物学特性有重大意义。同时成功筛选出的人源抗CPA-sc Fv,具有较强的生物学活性和免疫结合活性,也有利于治疗与预防CPA引起的食物中毒,在以后应用中能够避免人体产生人抗鼠抗体反应,减少了副作用,提高了安全性和有效性,为其他细菌性食物中毒的救治提供了新方法。