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目的:大量的研究证据表明, MitoKATP通道开放在预处理抗心肌梗死中起着非常关键的作用,它是预处理心肌保护的终末效应器。然而最近的研究提示,缺血前MitoKATP通道开放起着启动预处理信号传导的作用。本研究旨在探讨MitoKATP通道开放在预处理心肌保护中的作用及其与ROS生成和PKC epsilon转位激活的相互关系,以及MitoKATP通道开放预处理的功能蛋白质组研究。方法:本课题采用培养成年大鼠心室肌细胞的模拟缺血/再灌注模型和H9C2心肌细胞的缺氧/复氧模型,分三部分进行。第一部分,培养的成年大鼠心室肌细胞随机分成5组,即对照组、缺血/再灌注组、200(mol/L DZ预处理组、200(mol/L DZ+400(mol/L MPG预处理组和200(mol/L DZ+2(mol/L CH预处理组。预处理后的心肌细胞均模拟缺血40min,再灌注30min。用MTT法、CK检测试剂盒、Na+-K+ATPase检测试剂盒和Western blot等方法分别检测细胞的活性、CK的释放、细胞Na+-K+ATPase活性和细胞色素C漏出线粒体的量。用免疫荧光和Western blot方法观察PKC epsilon的转位激活情况。第二部分,培养的H9C2心肌细胞随机分成5组,即对照组、缺血/再灌注组、200(mol/L DZ预处理组、200(mol/L DZ+400(mol/L MPG预处理组和200(mol/L DZ+2(mol/L CH预处理组。预处理后,细胞均被缺氧100 min,复氧30 min。通过标记PI和Hoechst33258以及JC-1,来检测心肌细胞的活性和线粒体膜电位的变化。第三部分,培养的H9C2心肌细胞随机分成2组,即对照组和200(mol/L DZ预处理组,分别富集两组细胞的磷酸化蛋白质,采用双向电泳和质谱技术,分离鉴定DZ预处理后心肌细胞内磷酸化蛋白的差异表达。结果:1. 模拟缺血/再灌注后,各组心肌细胞的活性显著降低 （p<0.01）, 但DZ预处理能课题由国家自然科学基金NO.30200089资助<WP=13>明显增加活细胞数量,与其他预处理组相差显著 （p<0.01）;该心肌保护效应能被MPG和CH消除。2. 模拟缺血/再灌注后, 各组心肌细胞CK的释放量明显增加 （p<0.01）, 但DZ预处理组细胞CK的释放量比较低,与其他预处理组相差显著 （p<0.01）; 而DZ+MPG预处理组和DZ+CH预处理组细胞CK的释放量较DZ预处理组显著增高（p<0.01）;其中以DZ+MPG预处理组增高最明显,与DZ+CH预处理组之间相差显著（p<0.01）。3. 模拟缺血/再灌注后,各组心肌细胞的Na+-K+ATPase活性显著降低（p<0.01）,其中DZ预处理组细胞Na+-K+ATPase活性较高,与其他预处理组相差显著（p<0.01）。4. 模拟缺血/再灌注后,各组心肌细胞明显细胞色素C的释放增加（p<0.01）,但DZ预处理组细胞色素C的释放较少,与DZ+MPG预处理组和缺血/再灌注组相差显著（p<0.01）。 5. 倒置荧光显微镜下观察,正常对照组细胞内可见散在的少数几个点状荧光;DZ预处理组心肌细胞内可见清晰的条状荧光,呈横向排列,与肌丝方向基本一致; DZ+MPG预处理组心肌细胞略有条状荧光;DZ+CH预处理组心肌细胞内分布有少量的点状免疫荧光。Western-blot结果显示,DZ预处理后心肌细胞内的PKC epsilon向膜质部分转位明显（p<0.01）;ROS清除剂MPG和PKC特异性抑制剂CH均能抑制DZ预处理引起的PKC epsilon转位激活（p<0.01）,其中以CH作用最明显（p<0.01）。6. 缺氧/复氧后,各组H9C2心肌细胞PI阳性率显著增加（p<0.01）;DZ预处理组细胞的PI阳性率显著降低（p<0.01）,但该作用可被MPG和CH拮抗。7. 培养的H9C2心肌细胞缺氧/复氧损伤后,各组线粒体膜电位下降明显（p<0.01）;DZ预处理可以升高细胞线粒体膜电位;而当用MPG或CH与DZ共同预处理时,该作用被完全消除。8. 经MALDI-TOF-MS鉴定,差异表达的磷酸化蛋白质有:糖调节蛋白（GRP94）、胞吐相关蛋白重链I、铁蛋白轻链、TCP-1蛋白（CCT） zeta 亚单位和假想蛋白XP346548等。结论:1.大鼠心室肌细胞模拟缺血/再灌注损伤模型是研究预处理心肌保护的一种非常有效的细胞模型。2.MitoKATP通道特异性开放剂DZ预处理心肌细胞,对大鼠心室肌细胞模拟缺血/再灌注损伤和H9C2心肌细胞缺氧/复氧损伤都有保护作用,表现在延缓细胞的死亡、减少细胞内CK的释放和线粒体细胞色素C的漏出、增加细胞内Na+-K+ATPase的活性,<WP=14>以及防止线粒体膜电位的降低。3.PKC epsilon参与了MitoKATP通道开放预处理心肌细胞的信号传导,开放MitoKATP通道能引起PKC epsilon由胞浆向肌丝样结构的转位, 它可能是MitoKATP通道的下游信号分子。ROS清除剂能部分阻断PKC epsilon的转位激活,在MitoKATP通道开放预处理的信号传导中,ROS可能PKC epsilon的上游信号分子。4.在MitoKATP通道开放预处理过程中,阻断ROS的生成能消除心肌保护效应。 ROS可能是MitoKATP通道开放预处理心肌保护机制中重要的信号分子,预处理期使用自由基清除剂不利于心肌保护。5.MitoKATP通道特异性开放剂DZ预处理心肌细胞,可能使糖调节蛋白（GRP94）、胞吐相关蛋白重链I、铁蛋白轻链等蛋白发生了去磷酸化修饰,而分子伴侣包含TCP-1蛋白（CCT） zeta 亚单位和假想蛋白XP346548等发生磷酸化修饰。这些发生了磷酸化修饰改变的蛋白质可能参与了MitoKATP通道开放预处理心肌保护。