副猪嗜血杆菌和猪源多杀性巴氏杆菌是养猪业常见病原菌,其中副猪嗜血杆菌可引发猪多发性浆膜炎、肺炎、关节炎等,主要表现为发热、咳嗽、呼吸困难、消瘦、跛行、共济失调等临床症状。多杀性巴氏杆菌可引起猪肺疫、牛羊出血性败血症、禽霍乱等,对畜禽养殖业造成严重经济损失。泰地罗新（Tildipirosin）是大环内酯类动物新型专用抗生素,在欧盟被广泛用于预防和治疗由副猪嗜血杆菌、多杀性巴氏杆菌、传染性胸膜肺炎放线杆菌、溶血性曼海姆菌等病原菌引起的猪、牛等呼吸道系统疾病。泰地罗新目前在我国还未被批准上市,正处于研发阶段。由于抗生素的不合理使用,细菌耐药性现象越来越严重,亟需找到细菌耐药性传播、发生机制,并且制定合理给药策略,拟定科学、实效的耐药判定标准,减缓耐药性的发展。本研究通过测定临床分离的164株副猪嗜血杆菌和112株猪源多杀性巴氏杆菌对泰地罗新的敏感性（MIC）,运用统计软件（ECOFF-inder）建立野生型折点值;通过体内、半体内PK-PD同步模型,以及Monte Carlo模拟分析,建立合理的给药方案以及药效学折点值。通过选取JS0135（MIC=0.125μg/mL）进行人工诱导,获得耐药菌株JS50（MIC为32μg/mL）,对其进行二代转录组测序,确定疑似耐药基因,并比较诱导及天然耐药菌株和敏感的副猪嗜血杆菌在形态学上的差异。为进一步验证耐药基因,运用同源重组技术对高表达、差异显著的疑似基因进行敲除,构建突变（基因缺失）株,通过测定MIC观察敏感性变化,从基因水平上阐述耐药发生机制。1.副猪嗜血杆菌对泰地罗新耐药判定标准和最佳给药方案本研究通过临床分离全国各地2013²016年（湖南、湖北、安徽、山东等）164株副猪嗜血杆菌,通过琼脂稀释法对其进行体外（TSB）MIC测定,得到MIC₅₀和MIC₉₀分别为0.25μg/mL和2μg/mL。同时,筛选获得天然耐药菌株（高水平MIC）HB32（256μg/mL）。将测定所得的MIC值进行log₂对数转化,并运用Sigmastat软件进行正态分布检测,比较P值（0.20）,结果显示除去HB32株外,其余皆符合正态分布;运用非线性最小二乘法回归对数据进行多次拟合,从而确定最佳拟合范围为0.03125¹6μg/mL;在Excel中使用NORMINV函数,对拟合后的数据进行修正,设定野生型菌株分布的上限为99.9%,下限为0.1%,求出野生型菌株的上限值(39.5,2^5.30)及下限值(0.0034,2^-8.17)。运用NORMDIST函数代入平均值-1.436,标准差2.182及上限值（5、4、3、2、1）,推定至少包含95%的野生型菌株的MIC浓度作为野生型折点值。最终确定野生型折点值（ECV）为8μg/mL。与此同时,运用ECOFFinder软件对MIC数据进行回归拟合,最终同样确定ECV为8μg/mL,表明ECOFFinder软件更方便实用。选择血清型为5型的强毒力副猪嗜血杆菌SH0165（MIC=2μg/mL）,对泰地罗新的敏感性MIC值与MIC₉₀相同,以其作为代表,进行体外以及半体内药效学试验,包括在胰蛋白胨大豆肉汤（体外）、血清（50%血清+肉汤）中进行生长曲线和杀菌曲线试验。结果显示,泰地罗新对副猪嗜血杆菌的抑菌作用呈浓度依赖型,即随着浓度增加杀菌能力逐渐提高。选择14头健康、体重在25³0 kg之间的雌雄各半仔猪,其中取2头作为预实验,并建立泰地罗新的高效液相色谱检测方法（HPLC）,结果表明HPLC检测泰地罗新线性关系良好,特异性强,为国内首次使用液相方法在血浆及肺泡液中检测该药,其中最低定量限为0.025μg/mL,最低检测限为0.0125μg/mL。将12头仔猪随机分为两组（A和B组）,雌雄各半,以4 mg/kg肌内注射泰地罗新注射液（40 mg/mL）,其中A组检测血浆,B组检测肺泡液中泰地罗新药物浓度。分别于0¹0天以及0¹7天收集血浆以及肺泡灌洗液,并运用高效液相色谱仪对泰地罗新进行检测。使用WinNolin软件对获得的药时曲线数据进行拟合,选择非房室模型计算最终获得的重要药动学参数AUC_24h,AUC、C_max、CL_b分别在血浆中为4.25μg*h/mL,14.16μg*h/mL,1.01μg/mL,0.283 L/h*kg,在肺泡液中拟合为83.13μg*h/mL,855.46μg*h/mL,4.06μg/mL,0.005 L/h*kg。比较肺泡液以及血浆中药动学主要参数,发现肺泡灌洗液中AUC和C_max要显著高于血浆中,而CL_b却显著低于血浆中,该研究表明泰地罗新与肺脏组织亲和力强,药物主要聚积在肺组织中。然而国外已有报道指出肺泡灌洗液所测得的药动学数据不够严瑾,虽然对于大环内酯类药物,如泰地罗新,其作用靶部位为肺组织,然而肺泡灌洗技术尚存在不足,如操作复杂,只能通过尿素氮的比例间接检测药物含量,操作过程中易损伤肺泡组织造成药物外泄,另外,副猪嗜血杆菌是严格的胞外感染菌,通过肺泡灌洗技术获得的药物浓度在肺泡液中代谢特征表现为异常缓慢,并且该虚高的药物浓度并不能真实的、动态的反映肺泡液中药物代谢分布情况。因此推荐使用血浆作为靶部位,以血浆中药动、药效学数据进行PK-PD同步模型拟合,用于后续研究。结合半体内（50%血清）药效学（杀菌曲线）以及血浆中药动学数据,运用PK-PD同步模型（Inhibitory Sigmoid Emax）拟合得到,泰地罗新治疗副猪嗜血杆菌病达到杀菌活性（E=-3）的靶点值为52.27 h。使用Crystalball软件,运用Monte Carlo模拟10000头猪的AUC预测值,以52.27 h作为靶点值（target）,分别计算AUC/MIC的达标率（大于或等于治疗靶值“target”）,当达标率刚好大于95%时,则此时的MIC值为其药效学折点值。经拟合计算分析得到,泰地罗新对副猪嗜血杆菌的药效学折点值为0.5μg/mL（体外）,此时达标率为96.54%。根据美国临床实验室标准CLSI以及欧盟药敏试验联合委员会EUCAST指导原则,在没有临床折点临界值数据时,比较野生型折点以及药效学折点值,当前者包含后者时,以野生型折点为最终的敏感性折点值,因此,最终确定的耐药判定标准为8μg/mL。与此同时,运用剂量运算公式,以及Monte Carlo模拟10000头份的群体给药剂量,结果显示,泰地罗新对副猪嗜血杆菌的预防、治疗以及根除剂量（90%群体治疗率）分别为2.07、4.17、5.78mg/kg。推荐治疗我国副猪嗜血杆菌病感染,以4.17 mg/kg给予泰地罗新可达到治疗效果,以5.78 mg/kg可达到根除效果。本研究对2013²016年全国部分地区（湖南、湖北、安徽、广东等）病料,分离、鉴定获得112株猪源多杀性巴氏杆菌。运用副猪嗜血杆菌对泰地罗新的耐药判定标准方法以及剂量预测模型类推,制定出泰地罗新对猪源多杀性巴氏杆菌的敏感性折点值为4μg/mL;泰地罗新对猪源多杀性巴氏杆菌的预防、治疗以及根除剂量（90%群体治疗率）分别为4.12、6.35、7.64 mg/kg。推荐治疗我国猪源多杀性巴氏杆菌病感染,以6.35 mg/kg给予泰地罗新可达到治疗效果,以7.64 mg/kg可达到根除效果。然而,以上结果仅为实验室条件下预测结果,仍然需要在临床实践中加以验证。2.副猪嗜血杆菌耐药株与敏感株比较转录组学研究为探究副猪嗜血杆菌对泰地罗新的耐药分子机制,本研究通过对4型强毒力菌株JS0135（由华中农业大学农业微生物国家重点实验室提供）进行耐药诱导,经过连续诱导50代,药物浓度由低至高,获得耐药菌株JS50,其敏感性由0.125μg/mL升高至32μg/mL,且耐药性保持稳定,由耐药判定标准可知为耐药菌株。对JS50和JS0135进行转录组学测序,测定mRNA的表达量,结果显示,有349个上调以及113个下调差异显著的基因（P≤0.05,FC≥2）,差异基因主要集中在代谢、转运通路,核糖体蛋白合成,细胞膜通透性,膜蛋白合成、转运等通路。其中代谢途径中HAPS_RS09315、HAPS_RS09320、HAPS_RS08950、HAPS_RS08955在JS50中的表达量为上调超表达,表明副猪嗜血杆菌对泰地罗新的耐药机制可能由某些代谢途径调控。ABC转运途径中HAPS_RS10945和HAPS_RS03625等,核糖体蛋白合成途径中HAPS_RS07815基因等皆为上调高表达的差异基因,同样也是本研究中疑似的耐药基因,这些通路中的差异基因结果表明,副猪嗜血杆菌对泰地罗新的耐药机制可能与以上通路相关。通过透射电镜比较诱导的耐药菌株JS50、天然耐药菌株HB32以及敏感菌株JS0135细胞膜变化,结果显示,耐药菌株细胞膜较敏感菌株较为粗糙,通过生长曲线比较,诱导的耐药菌株较敏感菌株生长更快,但是细菌量较少。该结果表明,与敏感菌株相比,耐药菌株的生长差异和逃避抗生素的抑制可能与代谢或者细胞膜转运蛋白、通透酶活性等相关,该结果与测序结果（代谢以及ABC转运蛋白通路上大量基因上调）相符,但以上结果仍需要进一步验证。3.HAPS_RS05545、HAPS_RS05435、HAPS_RS03625缺失株对泰地罗新的抗性研究HAPS_RS05545、HAPS_RS05435、HAPS_RS03625编码副猪嗜血杆菌ABC转运蛋白通透酶,调控膜蛋白的通透性,其在细胞耐药机制中起着关键性作用。本研究在代谢、ABC转运蛋白途径中选择上调的高表达基因7个进行基因敲除,最终成功构建HAPS_RS05545、HAPS_RS05435、HAPS_RS03625缺失株。根据同源基因重组原理,构建与目标缺失基因具有相同同源臂的自杀性载体“PK18mobsac-目标基因”,转化至JS0135菌株当中,经PCR、抗性筛选及测序鉴定,确认获得具有卡那霉素抗性的“HAPS_RS05545、HAPS_RS05435、HAPS_RS03625”基因缺失株。通过生长曲线测定发现,缺失菌株无明显变化,表明“HAPS_RS05545、HAPS_RS05435、HAPS_RS03625”基因缺失对细菌的生长无影响,通过对泰地罗新敏感性试验,即最小抑菌浓度测定（MIC）,结果显示,在24 h时,“HAPS_RS05545、HAPS_RS05435、HAPS_RS03625”基因缺失株MIC值较JS0135野生型株下降2⁴倍,然而在36⁴8h时,基因缺失株MIC逐渐恢复,但仍然表现为下降趋势,表现为MIC下降1²倍。HAPS_RS03625、HAPS_RS05435和HAPS_RS05545基因缺失对泰地罗新敏感性起不同程度的影响（耐受性下降的趋势）,其中HAPS_RS5545基因的影响最大。通过透射电镜观察耐药菌JS50、敏感菌JS0135、缺失菌JS0135△5545膜变化,结果显示耐药菌株JS50外膜较JS0135更为光滑,缺失菌JS0135△5545、敏感菌JS0135较为粗糙。以上结果表明,副猪嗜血杆菌对泰地罗新的耐药机制可能与ABC转运通透酶有关,其中HAPS_RS05545、HAPS_RS05435、HAPS_RS03625的缺失可引起JS0135对泰地罗新敏感性增强。本研究通过耐药筛选、给药方案制定、转录谱测序以及对疑似耐药基因验证,最终揭示副猪嗜血杆菌对泰地罗新耐药机制与细菌膜通透性有关。然而细菌耐药机制复杂,基因之间的相互调控作用关联紧密,在本研究中,转录谱结果显示仍然有大量与耐药有关的差异上调基因以及下调基因,这些差异表达基因仍然需要进一步研究。本课题可为研究细菌基因功能提供新思路,为制定治疗细菌耐药性提供新的方向。