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第一部分石见穿醇提物、乙酸乙酯部位、氯仿部位、单体熊果酸与多西紫杉醇体外相互作用评价研究目的：中药抗肿瘤历史悠久应用广泛,近年来关于具有抗肿瘤作用中药的报道日益增多。但中药单独应用抗肿瘤作用较弱,中药的抗肿瘤价值更多的体现在与传统化疗药物联合发挥其协同增敏作用。目前关于具有协同增敏作用的中药或中药成分研究较少,中药或中药成分是否能特异性改变化疗疗效相关基因,发挥特异性化疗增敏作用更是鲜有报道。本实验室前期研究,在活性指导下分离鉴定出的石见穿活性部位及单体熊果酸具有有效的体内外抗肿瘤活性。本实验旨在进一步研究石见穿各活性部位及其单体熊果酸与多西紫杉醇的相互作用,并从分子水平探讨其协同机制是否与特异性改变紫杉疗效相关基因表达有关。材料与方法：本部分实验以人胃癌BGC-823为研究对象,研究石见穿中药提取物[醇提物(ethanol extraction part, EAP)、乙酸乙酯部位(ethylacetate extraction part, EYP)、氯仿部位(trichloromethane extraction part, TCP)及其单体熊果酸(Ursolic Acid, UA)]与多西紫杉醇(Docetaxel, Doc)对胃癌BGC-823细胞的体外相互作用及可能机制。1.MTT法检测EAP、EYP、TCP、UA、Doc单独应用以及EAP、EYP、TCP、UA分别联合Doc对BGC-823细胞增殖的影响。采用中效原理评价EAP、EYP、TCP、UA与Doc的交互作用,判定药物间是否具有协同作用。2.流式细胞仪检测各单药或联合用药对BGC-823细胞凋亡的影响。3.荧光定量RT-PCR分析EAP、EYP、TCP、UA对BGC-823细胞紫杉疗效相关基因BRCA1、RAP80、β-tublinⅢmRNA表达水平的影响。结果：1.MTT实验结果表明石见穿活性部位EAP、EYP、TCP及单体UA与Doc对BGC-823细胞均具有浓度依赖性的增殖抑制作用,以TCP对其抑制作用最强,其对BGC-823细胞IC5o值为(80.14±2.49)μg/ml,低于单体UA(81.95±1.53)μg/ml。中效原理评价：EAP、UA、TCP与Doc联用在低细胞毒浓度范围(IC30左右效应浓度范围)内联合指数(CI)小于1,提示EAP、TCP、UA与Doc具有协同作用；EYP与Doc联合在全部效应范围内CI均大于1,即石见穿乙酸乙酯部位与多西紫杉醇无协同作用。2. EAP40μg/ml、TCP25μg/ml、UA30μg/ml、Doc1μg/ml,单药或联合作用BGC-823细胞48h后检测细胞凋亡情况：对照组、EAP、TCP、UA与Doc单药组细胞凋亡率分别为(4.633±1.81)%、(12.6±1.53)%、(10.7±2.41)%、(11.73±1.76)%、(35.4±1.42)%,与Doc联合用药凋亡率分别为(55.87±2.95)%、(41.97±1.44)%、(58.13±1.56)%。联合用药与单药相比凋亡比率显著增加,差异具有统计学意义(p<0.005)3. EAP、TCP、UA以IC30左右效应浓度作用于BGC-823细胞48h,EAP及TCP均能够使BGC-823细胞紫杉疗效相关基因BRCA1、RAP80的表达水平上调,其中BRCA1分别被上调至1.08±0.03p=0.049)和12.82±0.21p=0.000)；RAP80分别被上调至1.64±0.07p=0.004)和3.66±0.51p=0.012),但对β-tublinⅢ基因水平的下调作用均不显著。单体UA对BGC-823细胞BRCA1、RAP80基因具有显著上调作用的同时(BRCA、RAP80分别上调至1.33±0.15和1.76±0.20),还能够有效下调β-tublinⅢ基因水平(下调至0.63±0.16)。结论：1、石见穿醇提物、氯仿部位及单体熊果酸与多西紫杉醇联合均具有不同程度的协同作用,其中以醇提物和熊果酸的协同增敏作用最好。2、协同机制与醇提物、氯仿部位及熊果酸能够与多西紫杉醇协同诱导细胞凋亡和有效上调紫杉疗效相关基因BRCA1、RAP80或下调β-tublinⅢ的表达水平有关。第二部分石见穿醇提物、乙酸乙酯部位、氯仿部位、单体熊果酸对紫杉醇耐药肺癌细胞A549/Taxol作用研究研究目的：本实验室前期在活性指导下分离鉴定出的石见穿抗肿瘤活性部位及单体具有有效的体外抗肿瘤活性。与多西紫杉醇体外交互作用实验结果也表明石见穿醇提物、氯仿部位及单体熊果酸与多西紫杉醇具有协同作用,其机制与有效上调紫杉疗效相关基因BRCA1、RAP80或下调β-tublinⅢ的表达水平有关。本部分实验进一步探讨石见穿各活性部位及单体熊果酸对紫杉醇耐药细胞A549/Taxol恶性生物学行为的影响,是否能够有效改变紫杉类疗效相关基因的表达,增加肿瘤耐药细胞对紫杉类化疗药物的敏感性,发挥逆转耐药作用。材料与方法：本部分实验以人肺腺癌细胞株A549及紫杉醇耐药肿瘤细胞株A549/Taxol为研究对象,研究石见穿醇提物(ethanol extraction part, EAP)、乙酸乙酯部位(ethylacetate extraction part, EYP)、氯仿部位(trichloromethane extraction part, TCP)及其单体熊果酸(Ursolic Acid, UA)对A549/Taxol细胞的增殖抑制作用、恶性生物学行为的影响、是否能够增加A549/Taxol细胞对紫杉醇的敏感性,发挥逆转耐药作用,并从细胞凋亡、细胞周期阻滞、紫杉疗效相关基因及多药耐药基因表达水平探讨逆转耐药的可能机制。1.比较A549/Taxol细胞与亲本A549细胞形态学、生物学特性、紫杉疗效相关基因及多药耐药基因表达水平变化。2.MTT法检测EAP、EYP、TCP、UA、Taxol对A549及A549/Taxol细胞的抑制率。比较两种细胞的药物敏感性,评价逆转耐药作用。3.小室法测定EAP、EYP、TCP、UA对A549/Taxol细胞侵袭力的影响。4.流式细胞仪检测中药单药或联合紫杉醇对A549/Taxol细胞凋亡的影响。5.流式细胞仪检测中药单药或联合紫杉醇对A549/Taxol细胞周期的影响6.荧光定量RT-PCR检钡A549/Taxol细胞紫杉疗效相关基因BRCA1、RAP80、β-tublinⅢ及多药耐药基因MDR1表达水平变化。结果：1. A549/Taxol细胞生长较亲本A549细胞明显增快,侵袭力增强；细胞周期分析显示A549/Taxol处于G1期的比例较A549增多而S期减少；经同浓度Taxol作用后A549/Taxol细胞凋亡数目较亲本A549细胞明显减少(p=0.000)。A549/Taxol细胞BRCA1、RAP80基因mRNA表达水平较亲本A549细胞显著降低,而多药耐药基因MDR1及β-tublinⅢ mRNA表达水平则显著升高。其中BRCA1mRNA下降至(0.0046±0.019)(P=0.001), RAP80mRNA下降至(0.0037±0.017)(p=0.000), MDR1mRNA升高(44.54±3.27)倍(p=0.034),β-tublin Ⅲ mRNA升高(4.71±0.98)倍(p=0.003)。2. Taxol对A549/Taxol细胞的半数抑制浓度(IC50)是其亲本细胞A549的48.358倍,同时表现出对Doc的耐药(耐药指数RI=27.208)。石见穿EAP、EYP、TCP及UA对A549/Taxol细胞的半数抑制浓度(IC50)分别为(55.128±11.48) μg/ml、(181.471±21.06) μg/ml、(35.425±8.83) μg/ml、(36.331±5.74) μg/ml,以TCP对A549/Taxol细胞的抑制作用最强。EYP对A549细胞的IC5o值为(74.588±16.75)μg/ml,与A549/Taxol细胞相比存在交叉耐药(耐药指数RI=2.43)。虽然TCP及UA对A549/Taxol细胞的增殖抑制作用强于EAP,但相同抑制浓度下EAP具有最强的逆转耐药效果{逆转倍数RF=(2.10±0.15), TCP. UA的RF分别为(1.56±0.087)、(1.54±0.096)}。3.石见穿EAP、EYP、TCP及UA均能够显著降低A549/Taxol细胞的侵袭力(p=0.000),其中以UA抑制侵袭作用最强。4. EAP12.5μg/ml、TCP6.25μg/ml、UA6.25μg/ml, Taxol400ng/ml单药或联合作用A549/Taxol细胞48h后,空白对照组A549/Taxol细胞的自然凋亡率为：(7.8±2.21)%,单药组细胞凋亡率分别为(10.3±3.66)%、(8.9±3.73)%、(13.1±2.29)%、(16.4±3.15)%。联合用药组细胞凋亡率分别为(42.2±7.73)%、(32.8±6.69)%、(66.8±10.68)%。联合用药与单药相比细胞凋亡比率显著增加,差异具有统计学意义(p<0.005)5. EAP、UA对A549/Taxol细胞的周期影响主要表现为S期阻滞,TCP单药对A549/Taxol细胞周期无阻滞作用。联合用药作用下,仅EAP联合Taxol增加了Taxol的G2/M期阻滞作用(p<0.05)。6. EAP12.5μg/ml、TCP6.25μg/ml、UA6.25μg/ml作用A549/Taxol细胞48h后RAP80基因mRNA表达水平分别被上调至8.210±1.75p=0.000)、5.654±1.75(p=0.015)、3.331±1.23(p=0.000);β-tublinⅢ分别被下调至0.496±0.14(p=0.004)、0.551±0.51p=0.014)、0.507±0.23(p=0.032)；仅TCP对A549/Taxol细胞BRCA1基因表达水平起到上调作用{上调至2.226±0.789(p=0.039)}；EAP、TCP、UA对MDR1基因表达水平的影响均不显著(p＞0.05)结论：1、与亲本A549细胞相比,紫杉醇耐药细胞A549/Taxol生长加快、侵袭力增强,对紫杉醇及多西紫杉醇均有良好的耐药性。2、石见穿醇提物、氯仿部位及单体熊果酸能够有效降低A549/Taxol细胞的侵袭力、增加其对紫杉醇的敏感性,其逆转耐药作用与有效上调A549/Taxol细胞紫杉疗效相关基因BRCA1、RAP80或下调β-tublinⅢ表达水平有关,而非影响多药耐药基因MDR1的表达。