【摘 要】
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从鸡毒害艾美耳球虫孢子化卵囊中提取基因组DNA,用Oligo6.0软件设计EnMIC-5基因特异性引物,通过PCR扩增出1 470 bp的片段,扩增产物再连接到pMD18-T载体中,经PCR扩增、酶切鉴
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从鸡毒害艾美耳球虫孢子化卵囊中提取基因组DNA,用Oligo6.0软件设计EnMIC-5基因特异性引物,通过PCR扩增出1 470 bp的片段,扩增产物再连接到pMD18-T载体中,经PCR扩增、酶切鉴定和测序分析后证明所克隆的1 470 bp片段核苷酸序列及其编码的氨基酸序列与GenBank中登录的微线蛋白5基因序列的相似性分别是99.7%和99.6%。按照pET-28(a)+载体的特点和克隆位点,用Oligo6.0软件设计了含BamH I和Xho I酶切位点的EnMIC-5基因的特异性表达引物,以重组pMD18-T-EnMIC-5质粒DNA为模板进行PCR扩增,扩增产物经BamH I和Xho I双酶切后,将外源EnMIC-5基因亚克隆到pET-28(a)+表达载体中,构建pET-EnMIC-5重组表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),经酶切、PCR和测序鉴定证明EnMIC-5基因正确插入到pET-28(a)+载体中。经ITPG诱导表达,表达产物通过SDS-PAGE和Western-blotting分析证实EnMIC-5基因在BL21中成功表达,分子质量大小为57.5 ku左右,与预期的分子质量大小一致,且能被鸡毒害艾美耳球虫阳性血清所识别;将重组蛋白免疫昆明小鼠,用间接ELISA检测,证实该重组蛋白具有良好的免疫原性,可诱导小鼠产生高滴度特异性抗体。本研究为鸡球虫微线蛋白结构与功能研究提供了依据和实验材料,为进一步研制基因工程疫苗提供了候选抗原。
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