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中心蛋白的分子量大约为20 kDa,属于EF-手超家族的一种酸性钙结合蛋白。中心蛋白第一次被识别是作为一种在有鞭毛的单细胞中纤毛的主要成分,后来它被发现普遍存在于中心体、中心粒、有丝分裂的纺锤体等。研究表明中心蛋白在微管组织中心的中心体复制与分离、依赖于中心蛋白的纤毛收缩、鞭毛切除反应等中发挥重要作用。游仆虫中心蛋白是一个包含168个氨基酸的单肽链钙结合蛋白,包含四个螺旋-环-螺旋的结构域,即EF-手结构域,每个结构域可结合一个钙离子。在其EF-loops区首个氨基酸都是保守的天冬氨酸,推测这些天冬氨酸在中心蛋白的金属结合性质中可能发挥重要作用。本论文利用分子生物学方法构建四个天冬氨酸的突变体,即每个loop区首个天冬氨酸突变成赖氨酸,经表达、纯化得到四个突变蛋白(D37K、D73K、D110K和D146K)。主要采用以下方法研究四个保守天冬氨酸在中心蛋白金属结合性质中的重要性。首先在生理条件下利用荧光光谱法考察了四个loop区突变后的金属结合性质。Tb3+与中心蛋白及突变蛋白的敏化实验进一步验证Tb3+与中心蛋白结合时优先与第Ⅲ、Ⅳ结合部位结合,即C-端优于N-端；第Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ结合部位的第一个氨基酸(Asp)突变成Lys后,其结合金属能力丧失,而第Ⅱ金属结合部位的第一个氨基酸(Asp)突变成Lys后,仍能结合金属离子,但荧光强度受到影响。应用铽滴定Lu2-D37K,得出Tb3+与中心蛋白loopⅡ的条件结合常数为(1.61±0.01)×105 L·mol-1；同时利用离子竞争法,得到Ca2+与中心蛋白loop II的条件结合常数为(3.52±0.08)×102 L·mol-1。得出金属离子与中心蛋白EoCen的结合顺序为Ⅳ>Ⅲ>Ⅰ>Ⅱ。运用荧光共振光散射技术研究了四个保守的天冬氨酸在Ca2+、Tb3+引起中心蛋白自聚集中的作用。实验表明,D37K和D146K突变体的聚集较小,说明Asp37和Asp146突变对蛋白的聚集有较大的影响,即N-端对蛋白的聚集影响很大,而C-端对蛋白的聚集有一定的协同作用,中心蛋白的聚集过程是整个分子的结合位点共同参与的。此外分别研究了TNS、离子强度、pH对Tb3+饱和的中心蛋白及突变体聚集的影响,得出在金属结合的蛋白聚集中疏水作用和静电作用共同起着作用,疏水作用占有很重要的地位。Asp37在金属结合的中心蛋白的聚集中很重要,且四个保守天冬氨酸对金属结合的中心蛋白聚集的贡献顺序为Asp37>Asp146>Asp110>Asp73。圆二色谱表明四个天冬氨酸突变后没有影响中心蛋白的二级结构。本文利用TNS作为疏水探针来研究四个突变体蛋白结合金属离子的构象变化情况,发现四个突变体的疏水面积暴露情况有所不同,EF-loops区的四个保守的天冬氨酸对保持中心蛋白的正确构象中的贡献顺序是：Asp37>Asp 146>Asp 110>Asp73。最后通过分子模拟再次验证了Asp37、Asp110和Asp146突变后对应的EF-loop区失去了金属结合能力,而Asp73突变后没有丧失金属结合能力,模拟所得到的结果与实验基本相符。