耐亚胺培南鲍曼不动杆菌OXA基因型及分子流行病学研究目的通过研究309医院临床耐亚胺培南鲍曼不动杆菌耐药谱和碳青霉烯酶OXA基因类型,阐明309医院产碳青霉烯酶鲍曼不动杆菌的分子流行病学特征及耐药机制,为指导临床合理应用抗菌药物和医院感染控制提供科学依据。内容鲍曼不动杆菌系条件致病菌,广泛分布于自然界及健康人的皮肤,并且可以长期定植于住院病人的皮肤、咽、呼吸道及消化道内,存活时间较长,是医院感染重要的条件致病菌之一,尤其在ICU病房常引起严重感染。2009年中国CHINET细菌耐药性监测网资料显示,鲍曼不动杆菌已成为造成ICU患者呼吸道感染的第三位细菌。尤其在免疫力低下的患者中,可以引起严重的甚至致死性的感染,如呼吸机相关肺炎、败血症、泌尿系统感染、脑膜炎等。由于鲍曼不动杆菌引起的感染率和死亡率日益增加,近年来引起临床医生及微生物工作者高度重视。自从1991年美国报道首例耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌(Carbapenemases resistant Acinetobacter baumannii, CRAB)暴发流行以来,世界各地陆续报告发现该菌株。国外学者发现在欧洲、北美、巴西、中国、台湾、香港、日本和韩国等地区耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌分离率呈递增趋势。由于该菌株一旦对碳青霉烯类耐药就意味着对现有临床常用抗菌药物表现很高的耐药率,使临床医生控制感染面临非常棘手的问题。因此,鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类抗菌药物耐药机制的研究及流行病学监测已成为全球研究的热点之一。大量研究表明,鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类耐药机制涉及因素较多,包括碳青霉烯酶产生、膜孔道蛋白缺失、药物主动外排泵的过度表达和青霉素结合蛋白改变等,其中碳青霉烯酶是最主要的耐药机制。碳青霉烯酶是指能够明显水解至少亚胺培南或美罗培南的一类β-内酰胺酶。依据Ambler分子分类法,可分为A类、B类和D类酶。A类和D类酶为丝氨酸酶,A类酶常见于肠杆菌科细菌；D类酶为苯唑西林酶(OXA),多见于不动杆菌。其中B类酶为金属酶,可见于铜绿假单胞菌、不动杆菌和肠杆菌科细菌。D类酶主要包括OXA-23、OXA-24、OXA-51和OXA-58等碳青霉烯酶基因型。在我国大陆的鲍曼不动杆菌中,碳青霉烯酶基因型以OXA-23型为主。本课题主要从两个方面研究耐亚胺培南鲍曼不动杆菌的分子流行病学特征。一方面从病原菌表型特征研究,包括细菌鉴定、细菌耐药谱的分析和碳青霉烯酶表型确认。另一方面从分子水平研究,包括碳青霉烯酶OXA基因类型、插入序列ISAbal与OXA基因耐药表达的相关性、验证鲍曼不动杆菌中OXA耐药基因水平转移的能力和鲍曼不动杆菌同源性分析。本研究阐明鲍曼不动杆菌分子流行病学特征及耐药机制,对指导临床医生合理应用抗菌药物,以降低死亡率,减少产酶菌株的发生和控制产耐药基因的传播具有重大的社会意义和现实意义。方法1、根据美国临床实验室标准化委员会(CLSI)2010版标准,应用生物梅里埃VITAK-2compare全自动微生物仪进行细菌鉴定和药敏试验,筛选309医院2010.08—2011.12住院患者非重复耐亚胺培南鲍曼不动杆菌分离株105株和环境分离株34株,共139株。2、应用改良Hodge试验对鲍曼不动杆菌产碳青霉烯酶菌株进行确认。3、采用多重PCR方法检测碳青霉烯酶OXA基因类型。采用PCR方法检测OXA-51基因和插入序列ISAbal,并验证插入序列ISAbal与OXA-51耐药基因表达的相关性。4、采用接合试验验证碳青霉烯酶OXA基因的水平转移能力。5、应用PFGE分子分型技术分析309医院鲍曼不动杆菌的同源性。结果1、鲍曼不动杆菌的耐药谱分析及碳青霉烯酶表型确认所有耐亚胺培南鲍曼不动杆菌对氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、氨曲南、头孢他啶等15种抗菌药物均表现高度的耐药率,临床分离株耐药率高达94.3%以上,而ICU环境分离株耐药率比临床株稍低,耐药率在78.9%以上。临床分离株仅对米诺环素和头孢派酮/舒巴坦(舒普深)具有较低的耐药率,分别为38.1%和21,9%；105株耐亚胺培南鲍曼不动杆菌,经改良Hodge试验(亚胺培南纸片法)检测,确证产碳青霉烯酶菌株为95株,阳性率为90.5%。2、鲍曼不动杆菌OXA类型和插入序列ISAbal与OXA-51基因耐药性表达的相关性共扩增105株临床分离的耐亚胺培南鲍曼不动杆菌,结果全部携带OXA-51基因,携带率为100%；95株菌株同时携带OXA-51和OXA-23基因,携带率为90.5%；只扩增到1株同时携带OXA-51和OXA-58基因；未扩增到OXA-24基因。34株ICU环境分离的鲍曼不动杆菌,100%携带OXA-51基因；50%同时携带OXA-51和OXA-23基因；未扩增到OXA-24和OXA-58基因。PCR扩增仅含有OXA-51基因的9株鲍曼不动杆菌的ISAbal插入片段,9株均具有ISAbal插入片段,为ISAbal-OXA51型,其中有两株菌株扩增到未知的较大片段。3、接合试验验证鲍曼不动杆菌中OXA基因水平转移的能力105株耐亚胺培南鲍曼不动杆菌进行多次接合试验,结果有两株含OXA-51基因的鲍曼不动杆菌,成功将ISAbal-OXA51片段转移到大肠杆菌E.coli J53受体菌中。然而96株OXA-23基因转移均未获得成功。4、耐亚胺培南鲍曼不动杆菌同源性分析78株分离于ICU鲍曼不动杆菌的PFGE图谱共得到55个PFGE带型,B聚类是最大的一类,其中PF-51、PF-52和PF-53带型菌株是ICU病房的主要流行株；34株鲍曼不动杆菌的PFGE图谱共得到26个带型,最大的一类是B聚类,其中PF-35带型菌株和PF-94带型菌株是ICU环境的主要流行株,这表明在环境中存在的与体内感染的鲍曼不动杆菌流行株属于不同亚种。PF-94带型菌株包括3株细菌,分别来源于医护人员的手、4床床单和l床床单,结果提示医护人员的手可能是鲍曼不动杆菌传播重要途径之一。结论1、从309医院临床和环境中共分离到鲍曼不动杆菌139株,对耐药谱进行分析,结果表明124株耐亚胺培南鲍曼不动杆菌对15种临床常用抗菌药物均表现很高的耐药性。2、利用改良Hodge试验建立了鲍曼不动杆菌产碳青霉烯酶的检测方法,亚胺培南纸片法的改良Hodge试验是检测鲍曼不动杆菌产碳青霉烯酶效果最好的方法。3、利用多重PCR对139株鲍曼不动杆菌进行OXA基因分析,结果表明鲍曼不动杆菌100%携带OXA-51基因；80.6%同时携带OXA-51和OXA-23基因；仅有1株菌同时携带OXA-51和OXA-58基因。4、临床和环境中分离的仅含有OXA-51基因的14株,在OXA-51基因上游具有插入序列ISAbal,为ISAbal-OXA51型,推测插入序列ISAbal与OXA-51基因表达量相关。5、鲍曼不动杆菌中OXA基因水平的转移能力可能与ISAbal相关。6、PFGE分析表明PF-51、PF-52和PF-53带型是临床患者分离的主要流行株。PF-35和PF-94带型是ICU环境分离的主要流行株,结果提示临床和环境分离的流行株属于不同亚型。