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目的:喉癌(laryngeal carcinoma)是头颈部常见的恶性肿瘤之一,在全球,喉癌占全身肿瘤的2.4%[1],其病理类型主要为鳞状细胞癌(laryngal squamous cell carcinoma,LSCC)。每年有超过15万的新发喉癌患者(Globocan 2012)。在中国,以东北、华北和华东地区发病率最高[2]。喉癌的病因迄今尚不完全明了,可能与吸烟、酗酒、空气污染、人类乳头瘤病毒感染等有关。目前,主要的治疗手段为手术、放疗、化疗及生物治疗等。虽然早期喉癌治疗效果较好,但晚期喉癌疗效和预后仍不尽人意,生存率低,并发症多,严重影响患者的生活质量,因而寻求有效的新的诊治指标意义重大。随着分子生物学及其技术的飞速发展,人们对喉癌发生、发展及其分子机制的研究更加深入。关于喉癌的发生发展的相关通路的研究也越来越受到重视。染料木素(染料木黄酮Genistein,Gen),又名4’,5’,7’-三羟基异黄酮,是在大豆异黄酮复合物中含量最高、营养价值最高的一种。染料木素是具有抗癌症作用的生物毒素单体。本课题组前期研究表明低浓度的染料木素能引起bcl-2基因m RNA相对表达量降低,当浓度增加至24μg/ml时,也可减少Survivin的表达;染料木素还可诱导Hep-2细胞发生细胞周期阻滞,主要阻滞在G2期,随药物浓度升高,S期阻滞的比率也增高。近来研究发现,染料木素能促进多种肿瘤细胞的凋亡,抑制癌细胞增殖和侵袭的能力,并通过介导PI3K/AKT信号通路调节肿瘤细胞生长[3]。血管内皮生长因子受体-3(vascular endothelial growth factor receptor-3,VEGFR-3)是受体酪氨酸激酶的一种,与VEGF-C及VEGF-D特异性结合后,可诱导内皮细胞增殖及迁移,调控血管及淋巴管内皮细胞的新生,对胚胎发育及肿瘤的生长和转移起着重要的调节作用[4]。VEGFR-3在大多数恶性肿瘤细胞中高表达,最近的研究表明,抑制VEGFR-3的表达通过调节AKT[4]、ERK[5]等下游信号通路,可诱导肿瘤细胞的凋亡、抑制肿瘤的增殖及侵袭能力。先前的研究证实,染料木素对前列腺癌细胞[6]、乳腺癌细胞[7,8]、胃腺癌细胞[9]、人结肠癌细胞[10]及人肝癌细胞[11]等有明显抑制作用,对喉癌细胞的作用却鲜有报道,另外,此类作用的相关机制也不清楚。因此,我们将研究染料木素对喉癌细胞功能的影响,探讨染料木素对喉癌细胞的“抗肿瘤作用”的相关机制,分析染料木素对喉癌细胞中VEGFR-3/PI3K/Akt/GSK-3β通路的影响。为染料木素应用于喉癌治疗提供理论基础,为最终提高临床喉癌的治疗效果寻找新的途径。方法:对照组:①Control组,用含10%胎牛血清RPMI 1640培养(后简称完全培养基)48小时,24小时换一次液;实验组:②MAZ51组,MAZ51为VEGFR-3的特异性阻滞剂,完全培养基培养18小时后,换含5μmol/L MAZ51的完全培养基预干预细胞6小时,更换为完全培养基培养24小时;③LY294002组,LY294002为PI3K的特异性阻滞剂,完全培养基培养18小时后,换含25μmol/L LY294002的完全培养基预干预细胞6小时,换为完全培养基培养24小时;④Gen组,完全培养基培养24小时后,更换为含12μmol/L染料木素的完全培养基作用细胞24小时;⑤MAZ51+Gen组,完全培养基培养18小时后,换为含5μmol/L MAZ51的完全培养基预干预细胞6小时,更换为含12μmol/L染料木素的完全培养基作用细胞24小时;⑥LY294002+Gen组,完全培养基培养18小时后,换为含25μmol/L LY294002的完全培养基预干预细胞6小时,更换为含12μmol/L染料木素的完全培养基作用细胞24小时。1流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测Hep-2细胞系各组间细胞凋亡的情况;2 CCK-8法检测不同浓度(0μmol/L,2.5μmol/L,5μmol/L,10μmol/L,20μmol/L,40μmol/L)染料木素对Hep-2细胞系增殖的影响;3 Transwell小室检测Hep-2细胞系各组间细胞的迁移能力和侵袭能力;4反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测不同浓度(0μmol/L,12μmol/L,24μmol/L)染料木素对VEGF家族各成员基因m RNA表达的影响;5实时荧光定量聚合酶链反应(Real-Time PCR)检测12μmol/L染料木素对Hep-2细胞系VEGFR-3和PI3K基因m RNA表达的影响;6 Western blot检测各组间AKT、GSK-3β蛋白表达及其磷酸化水平的改变。结果:1单独使用染料木素、MAZ51和LY294002均能诱导Hep-2细胞系凋亡,MAZ51和染料木素、LY294002和染料木素两两合用对Hep-2细胞系的凋亡诱导作用明显增强,与单独使用染料木素组比较有差异,与单独使用MAZ51或LY294002的组比较无明显差异。而MAZ51是VEGFR-3的特异性阻滞剂,LY294002是PI3K的特异性阻滞剂。当VEGFR-3或PI3K被特异性阻滞后,染料木素几乎不起作用,可推导染料木素的促凋亡作用是通过VEGFR-3,PI3K发挥作用的;2染料木素可抑制Hep-2细胞系的增殖,且抑制作用呈剂量依赖性;3单独使用染料木素、MAZ51和LY294002均能抑制Hep-2细胞的迁移能力和侵袭能力,MAZ51和染料木素、LY294002和染料木素两两联合应用对Hep-2细胞系的迁移和侵袭的抑制作用更强,与单独使用染料木素组比较有差异,与单独使用MAZ51或LY294002的组比较无明显差异。推导染料木素的促凋亡作用是通过VEGFR-3,PI3K发挥作用的;4 VEGFR-3在Hep-2细胞中表达恒定,且染料木素对VEGFR-3 m RNA的表达有抑制作用;5染料木素能抑制Hep-2细胞系的VEGFR-3和PI3K m RNA表达,抑制率分别为32%和63%;6单独使用染料木素、MAZ51和LY294002均能抑制Akt苏氨酸位点及丝氨酸位点和GSK-3β丝氨酸位点磷酸化的激活,使p-Akt(Thr308),p-Akt(Ser473)和p-GSK-3β(Ser9)蛋白表达的减少,MAZ51和染料木素,LY294002和染料木素两种药物合用抑制率更高。结论:1染料木素能促进Hep-2细胞的凋亡、抑制Hep-2细胞的增殖能力、迁移能力和侵袭能力。2染料木素能抑制VEGFR-3和PI3K的表达。3染料木素能抑制Akt和GSK-3β蛋白的磷酸化。4推导染料木素可作用于VEGFR-3/PI3K/Akt/GSK-3β信号通路发挥抗肿瘤作用的。