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气道重塑是支气管哮喘(简称哮喘)的一个重要病理特征,但其具体发生机制尚不明确。整合素(Integrin)是一种由α、β亚单位组成的二聚体糖蛋白,能通过独特的信号传导途径调控细胞生长、分化、增殖、凋亡等多个生理过程。现已证实,Integrin-β1广泛存在于气道平滑肌细胞(ASMC)表面,并能调控ASMC多个重要的生理过程,故可能对哮喘气喘重塑有重要影响。本研究通过构建靶向沉默小鼠Integrin-β1的shRNA表达载体,从体外、体内水平探讨Integrin-β1在哮喘气道重塑中的作用及其信号调控机制,从而确定哮喘治疗的新靶点。第一部分整合素-β1对哮喘气道重塑的影响目的探讨Integrin-β1对哮喘气道重塑的影响。方法设计并合成靶向小鼠Integrin-β1基因的shRNA表达载体,分别体外、体内转入哮喘小鼠模型ASMC,免疫荧光法检测体内外转染效率,RT-PCR及Real-time PCR法检测体外干预前后Integrin-β1mRNA表达变化;Western-blot法检测体外干预前后Integrin-β1蛋白表达变化;CCK-8法、BrdU ELISA法及流式细胞仪法检测体外干预前后ASMC增殖率及细胞周期分布时相的变化;Annexin V-PE/7-AAD双染法检测体外干预前后ASMC凋亡的变化;Transwell法检测体外干预前后ASMC迁移率的变化;ELISA法检测体外干预前后IL-6、IL-8的含量变化;肺组织病理切片观察体内干预前后哮喘小鼠模型气道重塑变化。结果shRNA表达载体能稳定转染哮喘小鼠ASMC,体外转染后的Integrin-β1的mRNA及其蛋白质水平均显著下调(P均<0.05);细胞增殖率减低(P<0.05),G0/G1期细胞比例增加(P<0.05),S期细胞比例降低(P<0.05);细胞凋亡率明显升高(P<0.05);此外,细胞迁移速率及IL-6、IL-8的含量则显著降低(P均<0.05);体内转染后的哮喘小鼠模型的气道重塑情况有所减轻。结论Integrin-β1能促使ASMC过度增殖、凋亡减缓、细胞迁移加速、炎症介质IL-6及IL-8分泌增多,引起气道平滑肌层增厚,是导致哮喘气道重塑形成的重要原因。第二部分整合素-β1在哮喘ASMC增殖信号网络中的作用及shRNA靶向干预研究目的探讨Integrin-β1对小鼠慢性哮喘模型ASMC增殖信号网络的调控及shRNA靶向干预作用。方法构建靶向小鼠Integrin-β1基因的shRNA表达载体,体外转入哮喘小鼠模型ASMC,免疫荧光法检测体内外转染效率,RT-PCR及Real-time PCR法检测干预前后CyclinD1、c-Fos的mRNA表达变化;Western-blot法检测干预前后ERK1/2、STAT6、p-ERK1/2、p-STAT6、CyclinD1及c-Fos的蛋白表达变化;CCK-8法、BrdU ELISA法及流式细胞仪法检测干预前后ASMC增殖率及细胞周期时相分布的变化。结果shRNA表达载体稳定转染哮喘小鼠ASMC后,CyclinD1和c-Fos的mRNA及其相应蛋白质水平均显著下调(P均<0.05),ERK1/2、STAT6蛋白表达未改变(P均>0.05),p-ERK1/2蛋白表达降低(P<0.05),而p-STAT6蛋白表达增高(P<0.05);体外转染后的细胞增殖率显著减低(P<0.05),细胞周期阻滞在G0/G1时相中(P<0.05)。结论哮喘ASMC内Integrin-β1/ERK1/2通路与IL-4/IL-13/STAT6通路间存在交互应答,而Integrin-β1能提高这两条通路的胞核内靶分子CyclinD1及c-Fos活性,可能是ASMC增殖信号网络的“分子开关”及影响哮喘气道重塑的作用机制所在;shRNA表达载体能靶向抑制Integrin-β1基因表达,可望成为哮喘气道重塑基因治疗的有效手段。