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家蚕（Bombyx mori,silkworm）是完全变态昆虫,蛹是由幼虫向成虫转变准备繁殖的特殊阶段,是生殖系统发育和成熟的重要时期。蛹期家蚕不摄食,生理发育所需所有物质和能量均来源于幼虫期的进食储藏。蚕蛹的脂质含量丰富,约占其干重的三分之一,而脂肪酸是其主要成分,约占总脂质的80%。脂肪酸已在多种生物中被发现能够影响其繁殖能力。家蚕既是鳞翅目重要模式生物,也是重要的经济昆虫,迄今鲜有脂肪酸与生殖关系的研究报道。本课题探讨了家蚕蛹期脂肪酸与雌性生殖的关系,结果如下:1.家蚕蛹期卵巢发育阶段划分通过解剖观察家蚕化蛹后第1天至第9天（羽化前一天）大造品系卵巢组织,发现化蛹后第1天和第2天卵巢生长缓慢,第3天开始迅速增长,直至羽化前充满体腔;化蛹后前5天无明显营养物质积累,第6天卵巢管最远端蚕卵（最早形成的蚕卵）颜色由白色变成淡黄色,卵体积增大,营养物质积累明显。随着发育,积累营养物质而逐渐成熟的卵在卵巢管中由远及近展开,至羽化前几乎所有蚕卵都积累了营养。结合卵黄生成期标志基因Bm EP80以及卵壳生成期标志基因Bm A.L12的表达分析结果,认为第3天雌蛹卵巢处于卵黄生成前期,第6天雌蛹卵巢处于卵黄生成期。2.家蚕蛹期脂肪酸含量分析利用气相色谱（GC）分别测定了雌蛹第1天、第3天、第6天和第9天蛹体（剖除卵巢）和卵巢内脂肪酸的相对含量。结果发现,检测到5种主要脂肪酸（C16:0、C18:0、C18:1、C18:2、C18:3）和7种微量脂肪酸（C15:1、C16:1、C17:0、C17:1、C20:0、C20:3、C14:0）。C18:3的相对含量最高,占总脂肪酸的37.69%-48.64%,C18:1占总脂肪酸的19.26%-20.28%,C16:0占14.09%-15.72%,C18:0占8.61%-14.12%,C18:2约占6.35%-8.50%。蛹体内主要脂肪酸在化蛹后1-6天含量较稳定,但化蛹第6天至第9天,蛹体内C18:3由48.21%减少至37.69%,而C18:0由8.61%增加至14.19%,这可能是因为家蚕蛹期生命活动所需能量更偏向由C18:3提供,或蛹后期C18:3合成减少导致的。卵巢中主要脂肪酸随蛹的发育而变化的幅度较大,化蛹初期卵巢内饱和脂肪酸（SFA）具有绝对的地位,约占总脂肪酸63%,但第3天SFA迅速下降至43%,而C18:1由12.94%增加至20.30%,C18:3由10.76%增加至26.18%。调查发现,第9天卵内C18:3相对含量要比蛹体内高,因此C18:3相对含量的降低也可能是卵子成熟过程中,脂质的转运优先选择不饱和脂肪酸（USFA）而造成的。C15:1、C17:0、C17:1三种组成银杏酸成分的脂肪酸相对含量在化蛹第9天蛹体内显著增加,可能与其能够抑制病原体滋生有关。C20:0含量在蛹期逐天增加,C20:3在化蛹第9天显著增加,可能与活性脂类合成有关;卵巢内微量脂肪酸在进入卵黄生成期后接近蛹体内比例,这是可能是由脂肪体内脂质大量转运造成的。3.家蚕卵巢转录组测序分析对雌蛹3天和6天卵巢进行转录组测序,共检测到912个表达差异基因（DEGs）。差异上调基因功能注释和富集分析发现,DEGs主要参与跨膜运输、翻译后修饰、细胞膜组成、脂类和糖类代谢、胞内运输以及肌动蛋白合成通路中,第6天差异高表达基因与观察到第6天卵巢营养物质快速积累的现象一致。对生殖相关DEGs进一步GO富集分析发现,DEGs涉及CYP基因、信号偶联蛋白基因、酶类基因、通道蛋白基因和膜受体基因等,涵盖生殖行为、性腺发育卵子发生、激素调节、信号传递、细胞迁移等多个方面。进一步对脂质运输和代谢相关的DEGs分析发现,基因主要富集到PPAR信号通路、USFA合成、脂肪酸延长等通路中。PPAR通路中的DEGs为3个SCD家族基因,可能与C18:1的合成有关;脂肪延长通路中富集的基因为HADH基因和两个超长链脂肪酸合成酶基因Bmelo10945（BGIBMGA010945）和Bmelo842（BGIBMGA000842）,同时Bmelo842又富集在USFA合成通路中,说明除脂肪酸延伸功能外,它可能还具有催化合成USFA的功能。表达相关性分析发现,Bmelo842、Bmelo10945和Bmcyp4g25与多种生殖相关基因共表达,推测其表达变化可能会影响雌性家蚕生殖性能。4.超长链脂肪酸合成酶对家蚕脂肪酸含量的影响RT-q PCR检测家蚕雌蛹卵巢3天至6天组织Bmelo842和Bmelo10945的表达量变化,发现前者在化蛹第6天表达最高,后者在第5天有表达高峰期,因此选择在雌蛹发育至第4天时进行干涉,24h后叠加注射。在雌蛹发育到第6天和第9天将其解剖,使用GC检测干涉后蛹体和卵巢内的脂肪酸相对含量。结果发现,干涉Bmelo10945后C18:1含量显著下降,微量脂肪酸中偶数碳脂肪酸的相对含量均下降,说明Bmelo10945可能参与两种脂肪酸合成过程,既脂肪酸的伸长和单不饱和脂肪酸（MUFA）的合成。干涉Bmelo842后发现C18:1和C18:3相对含量显著下降,而合成它们的底物C18:0和C18:2显著增加,说明可能Bmelo842参与C18:1和C18:3的生物合成,而基因表达沉默后底物则被累积。5.超长链脂肪酸合成酶对家蚕产卵的影响基因干涉后雌蛹均能正常发育,且卵巢发育和卵子成熟进度与对照组无明显差异。实验组雌蛾与正常雄蛾交配后调查产卵情况,每组统计15个蛾圈。对照组平均产卵354粒,注射ds Bmelo10945组平均产卵254粒,显著减少;注射ds Bmelo842组平均产卵336粒,没有显著变化。此外基因相关性分析发现,参与蜕皮激素信号传导的激素接受子3（Bm HR3）与Bmelo842、Bmelo10945具有显著表达相关性,干涉Bm HR3发现两个超长链脂肪酸合成酶基因表达显著下调,且干涉后蚕蛾平均产卵284粒,产卵数显著减少,与干涉Bmelo10945得到相似结果。说明Bm HR3可能在卵黄生成期作为上游基因调控了Bmelo842和Bmelo10945的表达进行调控。6.细胞色素P450（Bm Cyp4g25）对家蚕发育的影响在蛹第4天和前蛹期注射ds RNA沉默Bm Cyp4g25的表达发现,蛹期干涉的雌蛹发育正常,卵巢发育正常,蛹期持续时间与对照组无差异,而在另一蜕皮激素高峰期,即前蛹期,注射ds RNA观察到家蚕停止发育,6天后仍保持前蛹期状态,且其幼虫腹足、胸足和表皮不能退化。以上结果说明Bm Cyp4g25与蜕皮激素合成有关,在幼虫-蛹转变过程发挥重要作用。