论文部分内容阅读
前言:喉癌是常见的恶性肿瘤之一,其中以鳞状细胞癌最常见。喉癌的病因复杂,与吸烟、饮酒、暴露于有害的尘埃有关。尽管手术、化疗、放疗和免疫治疗等多种治疗技术不断进步,但在过去的10年中患者的5年总生存率并没有明显改善。因此,寻找喉癌初期诊断与个体化治疗的新型分子标志物是目前研究的热点。微小RNA(microRNA,miRNA)是一类长18~24个核苷酸的非编码小RNA,具有重要的分子生物学功能。研究发现,miRNA参与调节细胞的存活、自噬、增殖、凋亡以及迁移等重要生命过程。miRNA存在于人体多种体液中,在多种人类肿瘤中表达异常,参与多种肿瘤的发生发展,是目前极具价值的包括肿瘤在内的分子标志物。miR-181a是miR-181家族成员之一,可通过调控多种靶基因的表达,影响肿瘤细胞的增殖、粘附、侵袭和分化。研究证实,miR-181a在胶质瘤、宫颈癌、肺癌和乳腺癌中发挥“抑癌基因”作用,而在肝癌和胃癌中发挥“癌基因”作用。目前,miR-181a在喉癌中相关研究未见报道。通过MiRanda等软件预测,我们发现NPM1是miR-181a潜在靶标之一。近年来,对NPM1的研究主要集中在其与血液系统肿瘤的关系。此外,NPM1在包括前列腺癌、肝癌、肺癌等一些实体肿瘤中高表达,提示其在肿瘤中发挥癌基因作用。然而,NPM1在喉癌中相关研究亦未见报道。本研究应用相关分子生物学技术检测了miR-181a和NPM1在喉癌中的表达水平,鉴定了miR-181a的靶基因NPM1,并检测了二者在喉癌中分子生物学功能,为进一步探讨miR-181a在喉癌中的分子作用机制和作为喉癌分子标志物的可能性奠定了基础。材料与方法:1、细胞系和组织标本:人喉癌细胞系Hep2、人胚肾细胞系HEK293T、喉癌组织标本。2、实验方法:细胞培养、基因片段转染实验、qRT-PCR实验、流式细胞仪检测、CCK8实验和克隆形成检测、荧光素酶报告基因检测、SPSS统计分析。结果:1、qRT-PCR结果显示,与癌旁正常组织和HEK293T细胞相比,miR-181a在喉癌组织和Hep2细胞中表达水平显著降低(P<0.05),NPM1在喉癌组织和Hep2细胞中表达水显著增高(P<0.05),二者转录表达水平呈显著负相关关系(r=-0.4185,P<0.01)。Western blot结果显示,与癌旁正常组织和相比,NPM1在喉癌组织中蛋白表达水平显著增高(P<0.05)。上述结果提示miR-181a和NPM1在喉癌中分别发挥潜在抑癌基因和癌基因作用。2、荧光素酶报告基因实验结果显示,在Hep2细胞系中,LutNPM1-Wt+mi R-181a mimic共转染组报告基因活性较对照组显著下降(P<0.05)。Real-time PCR和Western blot结果显示,转染miR-181a mimic或mi R-181a inhibitor后48h,与对照组相比,Hep2细胞中NPM1 mRNA和蛋白表达水平分别显著降低和增高(P<0.05)。上述结果提示NPM1是miR-181a的靶基因。3、CCK8和克隆形成实验结果表明,与对照组相比,miR-181a mimic转染组中Hep2细胞的增殖及克隆形成能力显著降低(P<0.05),miR-181a inhibitor转染组中Hep2细胞增殖及克隆形成能力显著增高(P<0.05),提示miR-181a抑制Hep2细胞的增殖。4、流式细胞术检测凋亡结果表明,转染miR-181a mimic或miR-181a inhibitor后48h,Hep2细胞的早期凋亡比例较对照组分别显著升高或降低(P<0.05),提示miR-181a促进Hep2细胞的凋亡。5、流式细胞术检测周期结果表明,转染miR-181a mimic后48h,与对照组相比,位于S期的细胞比例显著增加(P<0.05),而位于G0/G1期和G2/M期的细胞比例则显著减少(P<0.05),提示miR-181a通过诱导细胞发生S期阻滞,进而抑制喉癌细胞的增殖。6、CCK8和克隆形成实验结果表明,与对照组相比,过表达NPM1转染组中Hep2细胞增殖能力及克隆形成数目显著升高(P<0.05),si-NPM1转染组中Hep2细胞增殖能力及克隆形成数目显著降低(P<0.05),提示NPM1促进Hep2细胞的增殖。7、流式细胞术检测凋亡结果表明,si-NPM1转染组中Hep2细胞早期凋亡比例较对照组显著升高(P<0.05),过表达NPM1组中Hep2细胞早期凋亡比例与对照组相比无明显差异(P>0.05),提示敲减NPM1可促进Hep2细胞早期凋亡。8、流式细胞术检测周期结果表明,si-NPM1和NPM1转染后48h,与对照组相比,位于G0/G1期的细胞比例分别显著增加和减少(P<0.05);位于S及G2/M期的细胞比例分别显著减少和增加(P<0.05),提示NPM1通过诱导细胞由G0/G1期向S期的演进,进而促进喉癌细胞的增殖。结论:1、miR-181a和NPM1在喉癌中分别下调和上调,二者在转录水平呈负相关关系,提示二者在喉癌中分别发挥抑癌基因和癌基因作用。2、NPM1是mi R-181a直接靶基因。3、miR-181a和NPM1分别抑制和促进喉癌细胞增殖,其中前者通过S期阻滞抑制喉癌细胞增殖,而后者通过诱导G0/G1期向S期的演进促进喉癌细胞增殖。4、mi R-181a和NPM1分别促进和抑制喉癌细胞早期凋亡,而且,NPM1回复mi R-181a对喉癌细胞凋亡的促进作用,提示mi R-181a通过抑制NPM1促进喉癌细胞凋亡。