非酒精性脂肪肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是除饮酒及其他明确的肝损伤因素外,以弥漫性脂肪变性(steatosis)和肝脏脂肪异常堆积为主要特征的肝脏疾病。NAFLD的出现与肝细胞发生的异常的脂质堆积关系密切。NAFLD在发达国家已影响了约1/3的人口,是导致慢性肝病的最常见原因。我国人民生活水平日益提高,NAFLD发生率也逐年升高,随着肝炎疫苗接种的普及和治疗水平的提高,NAFLD将成为肝硬化(cirrhosis)和肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)的首要病因。当肝细胞异常脂质蓄积超过其代偿能力时,过量的脂质连同其代谢产物对肝细胞产生一系列的损害和影响,被称为脂毒性(lipotoxic)损伤,主要包括氧化应激(oxidative stress)、炎症和内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ER stress)等。在这些因素的作用下,NAFLD由单纯脂肪变向非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis,NASH)、肝纤维化(fibrosis)、肝硬化进展,甚至发生癌变。在哺乳动物细胞内,过量的脂质通常以中性脂质(neutral lipid)[包括胆固醇酯(cholesterol ester,CE)和甘油三酯(triglyceride,TG)]的形式存储于脂滴(lipid droplets,LDs)中。脂肪代谢在肝脏异常活跃,因此脂滴是肝细胞正常脂代谢的重要的“缓冲系统”,在脂质代谢稳态的维持中有着非同寻常的意义。然而,脂滴增大和过多是NAFLD的一个重要病理学标志,且肝细胞内脂滴的数量和大小与NAFLD进程密切相关。长久以来,脂滴通常被认为是一个单纯的细胞内中性脂肪的存储场所。近年来,愈来愈多的研究指出,脂滴是一个多功能的代谢活跃的细胞器(organelle),其不仅仅参与了脂质的储积,还参与了多种代谢过程,如能量供应、细胞膜的合成等。脂滴的多种功能受到其表面蛋白的调节,其中Perilipins是脂滴的重要标志分子。Perilipin 5(Plin5)作为一个关键的脂滴蛋白(lipid droplet protein,LDP),不仅保持肝细胞内脂肪的相对稳定,还参与调节脂滴的代谢过程。在小鼠和人体内,Plin5主要表达于脂质代谢旺盛的器官,如肝脏、心脏、骨骼肌和棕色脂肪组织(brown adipose tissue,BAT)等。前期实验中,我们利用Plin5敲除小鼠发现,Plin5缺失的肝脏表现出脂肪含量显著减少,提示Plin5参与肝脏脂肪代谢的调节。进一步研究表明,Plin5能够抑制脂滴中甘油三酯的脂解和/或降低脂肪酸氧化速度,并促使整体细胞内脂质积累,但具体调控机制和在疾病发生中的具体作用仍待深入探索。他汀类药物(statins)是临床上应用最普遍的最具有代表性的调脂药,能够抑制羟甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-coenzyme A reductase,HMGCR)活性,主要用于降低血中胆固醇含量,被普遍使用于高胆固醇血症、动脉粥样硬化(atherosclerosis)等血脂异常疾病的治疗。随着应用的普及,人们逐渐发现他汀类药物还具有多效性,能够发挥氧化应激、炎症反应、恢复内皮细胞等降脂以外的作用。近来,诸多研究提示,他汀类药物能够抑制肝脏炎症、纤维化,甚至对肝细胞肝癌也有着保护作用。最近有研究认为,阿托伐他汀能够抑制肝脏中Plin5的表达,从而增加肝细胞脂解速度,但其作用机制仍有待进一步深入。目的:1.探讨阿托伐他汀对NAFLD患者肝脏脂质储积的影响。2.利用Plin5基因敲除小鼠,明确脂滴蛋白Plin5在阿托伐他汀治疗脂肪肝中的作用。3.通过探讨阿托伐他汀调控Plin5磷酸化对肝脏脂肪代谢的影响,探讨其分子机制。方法:1.按照纳入标准和排除标准,我们搜集了我院就诊的口服阿托伐他汀钙治疗6个月的患者资料,根据其影像学和肝功能检查,确定其是否有脂肪肝及脂肪肝的严重程度。从中选取了101例患有不同程度NAFLD患者,按照体重指数分为正常体重组(18.5≤BMI<24,n=48)和超重组(BMI≥24,n=53),分析了阿托伐他汀对两组患者脂肪肝的影响。2.利用高脂饲料(high-fat diet,HFD)喂养小鼠,使其肝脏脂质储积,并通过给予阿托伐他汀灌胃,确定阿托伐他汀对肝脏脂质含量和Plin5表达水平的影响;进一步利用阿托伐他汀处理野生型和Plin5缺失的小鼠和原代肝细胞,探讨阿托伐他汀对肝脏和肝细胞脂质含量的影响,确定Plin5在阿托伐他汀抑制肝脏脂质储积中的具体作用。3.通过亚细胞分离脂滴和胞质部分,分析阿托伐他汀处理后Plin5在脂滴和细胞质中含量变化。通过对脂滴水解和肝细胞脂肪酸氧化(fatty acid oxidation,FAO)的研究,明确阿托伐他汀与Plin5在脂滴水解和FAO中的作用及关系。进一步系统分析了Plin5分子中蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)、蛋白激酶B(protein kinase B,PKB)/AKT、AMP依赖的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)等磷酸化结构域上的磷酸化修饰情况,明确阿托伐他汀与Plin5的磷酸化与肝脏脂肪代谢的关系。结果:(1)阿托伐他汀能够降低脂肪肝患者肝脏内的脂质储积在临床上,我们搜集了口服阿托伐他汀钙治疗6个月的患者资料,并分析了其中101例患有不同程度脂肪肝的患者。结果发现,口服阿托伐他汀钙6个月后,所有患者谷丙转氨酶(alanine transaminase,ALT)、谷草转氨酶(aspartate transaminase,AST)、总胆红素(total bilirubin,TBIL)、直接胆红素(direct bilirubin,DBIL)、间接胆红素(indirect bilirubin,IBIL)等无明显变化,但血中甘油三酯(TG)和总胆固醇(total cholesterol,TC)的水平显著降低,且对超重(BMI≥24)患者的效果尤为明显。我们进一步分析了阿托伐他汀对脂肪肝的影响,结果发现,阿托伐他汀钙显著缓解了患者脂肪肝的严重程度,提示阿托伐他汀钙对脂肪肝具有潜在治疗作用。同时,阿托伐他汀钙对超重患者脂肪肝也具有更好的改善效果。综上所述,阿托伐他汀钙可以显著改善脂肪肝患者肝脏的脂质储积。(2)阿托伐他汀通过抑制Plin5表达降低肝脏的脂质储积已有研究表明,Plin5可促进肝脏中脂质储积,而Plin5缺失促进肝细胞中脂滴的水解,诱发脂毒性损伤。为了进一步研究Plin5在阿托伐他汀抑制肝脏脂肪储积中的作用,利用高脂饲料(high-fat diet,HFD)喂养小鼠,使其肝脏脂质储积,并通过给予阿托伐他汀灌胃,确定阿托伐他汀对肝脏脂质含量和Plin5表达水平的影响;进一步利用阿托伐他汀处理野生型和Plin5缺失的小鼠和原代肝细胞,探讨阿托伐他汀对肝脏和肝细胞脂质含量的影响,确定Plin5在阿托伐他汀抑制肝脏脂质储积中的具体作用。结果表明,阿托伐他汀可有效降低小鼠肝脏TG及胆固醇的含量。在降脂的同时,阿托伐他汀能够在一定程度上减低肝脏Plin5的表达,而其他脂滴表面蛋白的含量没有明显影响,包括脂肪分化相关蛋白(adipose differentiation-related protein,ADRP)。更重要的是,对于Plin5缺失小鼠,尽管阿托伐他汀依然可以有效降低其肝脏中胆固醇水平,但对肝脏TG含量却没有明显影响。以上结果提示,Plin5在阿托伐他汀抑制肝脏脂质储积过程中具有重要作用。(3)阿托伐他汀通过促进Plin5的磷酸化促进肝脏脂滴水解为了进一步明确Plin5在阿托伐他汀抑制肝脏脂质储积的分子机制,我们首先分析了Plin5在脂滴和细胞质中含量变化。结果发现,阿托伐他汀可以显著抑制胞质中Plin5的表达,但并未直接改变脂滴表面的Plin5蛋白含量。进一步对脂滴水解和肝细胞FAO的研究结果显示,阿托伐他汀能够促进正常脂滴水解速度,增进脂肪酸的氧化速度,但不影响脂滴中Plin5的含量。这些结果提示,阿托伐他汀可能通过其他路径来调控Plin5依赖的脂解作用。磷酸化是Perilipins分子的常见调控方式,有研究发现Plin5的155位丝氨酸是其重要的磷酸化调控位点。我们进一步系统分析了Plin5分子中PKA、PKB/AKT、AMPK等磷酸化结构域上的磷酸化修饰情况。最后发现,阿托伐他汀增加HFD诱导小鼠肝脏PKA依赖的Plin5磷酸化。深入的研究发现,阿托伐他汀亦可激活PKA,导致Plin5的丝氨酸-155的磷酸化,影响其与比较基因识别-58(comparative gene identification-58,CGI-58)的相互作用,导致脂滴表面脂肪甘油三酯脂肪酶(adipose triglyceride lipase,ATGL)的活性增加,从而减少肝细胞中脂质储积。本部分研究结果不仅深入认识了阿托伐他汀促进脂滴水解的分子机制,也为探讨Plin5的调控方式提供了研究基础。结论:综上所述,我们通过分析患者的临床资料,发现阿托伐他汀能够降低脂肪肝患者肝脏脂肪含量,且对超重患者的效果更明显。在此基础上,利用Plin5敲除小鼠和原代肝细胞体外培养方法,我们发现了阿托伐他汀可能通过抑制Plin5的表达降低肝脏的脂质储积。在此基础上,我们进一步研究了阿托伐他汀对肝细胞脂滴水解的影响和机制,发现阿托伐他汀并未直接影响脂滴中Plin5的表达含量,而是促进Plin5的PKA依赖的磷酸化,从而促进肝脏脂滴水解,减少肝脏中的脂质积累。本实验从多方面系统探讨了阿托伐他汀抑制肝脏脂质储积的作用和分子机制,不仅有助于认识肝脏脂质代谢的关键调控机制,也为NAFLD的防治提供了实验基础。