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单倍体精子细胞经过一系列剧烈的结构和形态变化,最终发育为高度特化精子,此过程被称为精子形成。染色质重构和细胞核压缩是精子细胞发育和精子形成中的一个显著事件,期间组蛋白首先被转换蛋白替换,随后被鱼精蛋白取代;鱼精蛋白与DNA的结合使染色质压缩更为致密,导致精子细胞核被高度压缩。此外,转录后水平基因表达调控在精子形成过程中至关重要。由于细胞核压缩导致精子细胞的整体转录活性逐步降低,为后期精子细胞发育所需基因需要在精母细胞或/和早期精子细胞阶段提前转录为mRNA,通常需要与特定RNA结合蛋白形成RNP复合物,以翻译抑制状态被储存在精子细胞中,至特定发育阶段再被释放出来进行翻译激活;同时,精子是一种高度特化的细胞,几乎不含mRNA,在转化成精子前,精子细胞中大量的mRNA转录本将被降解清除。由于缺乏体外细胞培养系统和合适的动物模型,目前对于上述过程的分子机制还了解不多。本博士学位研究论文着眼于组蛋白-鱼精蛋白转换、精子细胞中的基因表达调控等重要事件,探究了PIWI/piRNA及相关蛋白因子在精子形成过程中的功能机制,主要包括以下三部分工作: 1.人PIWI(HIWI)蛋白泛素化修饰缺陷突变致男性不育 实验室的前期研究发现,小鼠PIWI(MIWI)蛋白在精子细胞发育后期将通过APC/C-泛素化通路被降解清除。本学位论文通过对无精症患者筛查,发现3个患者的人Piwi基因(Hiwi)基因存在拮抗泛素化修饰的D-box元件突变;通过构建基因敲入小鼠模型,我们证实该突变可导致小鼠雄性不育,表明此类突变是造成这些患者不育的致病原因。利用小鼠模型进行的机制研究表明,D-box突变导致MIWI异常稳定存在于后期精子细胞中,使得与其相互作用的组蛋白泛素连接酶RNF8被扣留在细胞质、无法入核催化组蛋白泛素化修饰,进而抑制组蛋白被鱼精蛋白替换,引发精子形成异常、雄性不育。这些研究结果首次证明Piwi基因可致男性不育,同时揭示了精子形成过程中组蛋白-鱼精蛋白转换的启动机制,并此类男性不育症的诊断与治疗提供理论依据和方法技术。 2.MIWI/piRNA介导小鼠睾丸中mRNA的切割降解 实验室的前期研究发现,小鼠粗线期piRNA与其结合蛋白MIWI及脱腺苷酶CAF1形成pi-RISC复合物,以类似miRNA的作用机制,诱导小鼠后期精子细胞中大量mRNA的脱腺苷化降解。本学位论文发现,当粗线期piRNA与睾丸组织中的靶mRNA完全或接近完全配对时,还可以类似siRNA的作用机制,指导MIWI对这部分靶mRNA转录本进行切割降解,揭示了piRNA调控靶mRNA的一种新机制及其在精子形成中的新功能。 3.MIWI相互作用蛋白FXR1在精子细胞基因表达调控中的功能机制 本实验室及国际同行均在小鼠睾丸的MIWI蛋白复合物中发现了G4四联体RNA结合蛋白FXR1。本学位论文研究确认了FXR1与MIWI直接相互作用,并发现FXR1在小鼠单倍体精子细胞中特异性高表达,且对早期精子细胞中的mRNA具有翻译抑制作用。后续研究将利用Fxr1基因敲除突变小鼠模型,深入研究其在精子发生中的功能机制,取得的研究结果将有助于我们更好的了解转录-翻译解偶联过程中的分子机制,对精子发生过程中复杂的基因表达调控有进一步的认识。