化疗延长了癌症患者的生存期,但接受化疗的患者也经常会出现一些化疗副反应,癌症患者化疗后出现处理速度的减慢,记忆力的损伤,无法集中注意力,语音功能受损,这些都可能与化疗相关,称之化疗引发的认知功能障碍,又称为“化疗脑”。化疗脑有时会严重影响癌症患者的生活质量,使其难以回归到之前的生活。随着乳腺癌发病率日益增高,治疗方法的层出不穷,大部分接受化疗的乳腺癌患者能长期生存,因此乳腺癌患者是化疗后出现认知功能障碍的主要群体。紫杉类和蒽环类药物是治疗乳腺癌最常用的化疗药物。尽管蒽环类药物阿霉素不作用于神经系统,也无法通过血脑屏障,但阿霉素仍能损伤认知功能,诱发啮齿类动物和癌症患者出现化疗脑症状。因此,预防和缓解癌症患者的化疗脑症状对疾病的治疗和重新开始正常生活有着重要意义。一些药物,如虎胆碱酯酶抑制剂,莫达非尼和一些抗炎药物在临床上都曾尝试用于治疗化疗脑,但效果甚微。因此,迫切需要发现新的方法来预防和治疗化疗诱发的认知功能障碍,从而提高癌症患者的生活质量。虎杖苷(Polydatin,PLD)是从虎杖根部提取的一种天然白藜芦醇苷。尽管PLD和白藜芦醇(Res)在体内可以相互转化,但摄入PLD或Res后,在血清中主要以PLD为主,提示PLD口服吸收率和代谢稳定性较Res更高。研究发现PLD具有多种生物学活性,如神经保护、抗炎、抗氧化、抗肿瘤和免疫调节等。研究发现PLD能够通过抑制氧化应激,缓解脂质过氧化而减轻化疗药物引发的机体损伤。此外,PLD还能够跨越血脑屏障缓解帕金森引发的运动功能退化,保护缺血再灌注引发的脑神经损伤、长期饮酒造成的认知障碍等。然而,虎杖苷是否能够保护化疗引发的认知功能障碍还未见报道。在本研究中,我们旨在研究PLD对化疗脑大鼠症状的影响,评估PLD对阿霉素引发化疗脑大鼠海马组织氧化应激、炎症反应和凋亡的保护作用以及可能的作用机制及通路。目的:阿霉素会引发癌症患者出现认知功能障碍,研究发现PLD具有多种生物学活性,如抗炎、抗氧化和免疫调节等,但PLD是否能够缓解化疗引发的认知功能障碍还未见报道。本研究评估PLD对阿霉素引发的认知功能障碍大鼠的神经组织形态结构的保护及空间学习/记忆能力和短期记忆能力的提升作用并评估PLD对DOX引发化疗脑大鼠海马组织氧化应激、炎症反应和神经元凋亡的保护作用及可能的作用机制及通路。方法:1.实验动物及分组:选取6周龄健康雄性SD大鼠,体重220±10g,(购自北京华阜康生物科技股份有限公司),适应性喂养1周。12h白12h黑温度22±1℃,湿度45-55%,自由进食水。通过大体观察选择不存在行为异常的大鼠进行水下游泳观察,剔除存在运动异常的大鼠。将24只雄性SD大鼠随机分为四组:1)Sham组(n=6);2)PLD组(n=6);3)DOX组(n=6);4)DOX+PLD组(n=6)。DOX组腹腔注射2mg/kg DOX,每周1次,持续4周。DOX+PLD组腹腔注射等量DOX,同时每日灌胃给予50 mg/kg的PLD持续4周。PLD组仅灌胃给予等量PLD,腹腔注射等量溶剂。Sham组腹腔注射等量溶剂,灌胃给予等量PLD溶剂。28天后进行水迷宫与下台回避测试,观察各组动物行为学变化。2.采用HE染色和甲苯胺蓝染色观察不同实验组间大鼠海马脑组织形态学变化。3.采用还原性谷胱甘肽(GSH)试剂盒和丙二醛(MDA)试剂盒检测大鼠海马组织GSH和MDA的含量,采用ELISA法检测大鼠海马组织COX-2、PEG-2和TNF-α的含量,免疫印迹法检测大鼠海马组织Nrf-2,p-IκBα,IκBα,p-p65,p65,cleaved caspase-3,cleaved caspase-9的表达情况以及TUNEL法检测细胞凋亡。所得数据用x±s表示,采用Graph Pad Prism 8.0(Graph Pad Inc.,USA)软件进行统计学分析,多个组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA),两两比较采用Student’s-t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。结果:1.水迷宫实验:本研究采用水迷宫实验来评估大鼠的空间学习和记忆能力(n=6)。DOX组大鼠的空间记忆能力较Sham组下降。而相比DOX组,DOX+PLD组空间记忆能力得到一定程度的改善。DOX组大鼠逃避潜伏期时间明显长于Sham组,两组间差异开始于试验的第二天。而DOX+PLD组较Sham组逃避潜伏期时间延长则开始于试验的第三天。随着时间的推移,DOX+PLD组较Sham组逃避潜伏期延长时间明显短于DOX组。此外,相比于DOX组,DOX+PLD组大鼠在靶象限停留的时间更长,而Sham组和PLD组间无明显差异。结果显示,PLD没有神经毒性,可以改善DOX诱导化疗脑大鼠的空间学习/记忆能力;2.下台回避测试结果:本研究采用下台回避测试评估大鼠的短期记忆能力。DOX组下台潜伏期时间为38.1±9.0 s,明显短于Sham组(123.5±24.8 s)。而加用PLD的DOX+PLD组大鼠下台潜伏期时间明显增加,达76.2±20.2 s。而Sham组和PLD组间无明显差异;3.HE染色结果:Sham组和PLD组:脑组织神经细胞数量丰富,组织间隙大小正常,胞浆均匀,细胞排列整齐,细胞核清晰可见。DOX组:发现大量神经元细胞核固缩坏死和神经元退化,神经细胞分布不均,间隙明显增宽。DOX+PLD组:相比DOX组,加用PLD后,镜下观察发现海马区脑组织中神经元发生核固缩及退化的数量明显减少,组织间隙趋于正常;4.甲苯胺蓝染色结果:DOX组海马区神经元细胞组织构架完全消失。而DOX+PLD组可见正常的神经元结构和细胞核;5.PLD对DOX诱发氧化应激和促炎症反应的影响:DOX可明显增加MDA含量(3.2±0.7 nmol/mgprot),加入PLD后,MDA水平降低(1.9±0.4nmol/mgprot),差异具有统计学意义(P<0.05)。DOX还能降低GSH水平(5.8±1.6μmol/gprot),加入PLD可显著提高GSH水平至接近正常(9.7±2.1μmol/gprot),差异具有统计学意义(P<0.05)。DOX使大鼠海马脑组织TNF-α、PGE-2和COX-2水平明显增高,分别为45.3±9.1 pg/mgprot、85.9±22.9 pg/mgprot和0.3±0.1 ng/mgprot。加用PLD后,TNF-α、PGE-2和COX-2水平明显降低至16.5±7.2 pg/mgprot、55.0±15.2 pg/mgprot和0.1±0.03 ng/mgprot,差异具有统计学意义(P<0.05)。而PLD组和sham组间无明显差异。结果显示DOX能触发海马组织的氧化应激和炎症反应,而PLD可以明显减轻DOX诱发的氧化应激和炎症反应;6.PLD抑制DOX诱发的神经元凋亡:TUNEL/DAPI荧光显示DOX组TUNEL阳性细胞数较sham组增加,而联合使用PLD可减少TUNEL阳性细胞数。免疫印迹法检测发现相比sham组,DOX组cleaved caspase-3和cleaved caspase-9表达明显增高,差异具有统计学意义(P<0.001)。而联合使用PLD可降低cleaved caspase-3和cleaved caspase-9的表达,差异具有统计学意义(P<0.01)。结果提示PLD可以抑制大鼠海马神经元凋亡;7.PLD对DOX诱发化疗脑大鼠海马区信号通路的影响:核因子E2相关因子(Nrf2)是对抗氧化应激的主要转录因子。我们发现PLD能明显增加Nrf2的表达。DOX+PLD组Nrf2的表达水平明显高于DOX组,差异具有统计学意义(P<0.01)。核因子-κB(NF-κB)与炎症反应相关。因此,我们检测了NF-κB通路相关蛋白的表达。发现DOX能增加p-IκBα和p-p65的表达,提示DOX可以激活NF-κB通路。而联合应用PLD能抑制IκBα和p65的激活,差异具有统计学意义(P<0.01)。结果表明PLD通过作用于Nrf2和NF-κB通路来预防DOX诱发的氧化应激和促炎症反应。结论:应用DOX成功建立了SD大鼠“化疗脑”模型;通过HE染色和甲苯胺蓝染色观察,加用PLD能够明显改善海马区神经组织形态,减少神经元发生核固缩及退化的数量。通过水迷宫实验和下台回避测试发现,加用PLD能够改善大鼠神经功能障碍,提升空间学习/记忆能力和短期记忆能力。PLD能抑制DOX诱发的氧化应激和促炎症反应。PLD可抑制大鼠海马神经元的凋亡。PLD通过作用于Nrf2和NF-κB通路抑制氧化应激炎症反应和凋亡来缓解阿霉素诱发大鼠的认知功能障碍。