论文部分内容阅读
本研究以猪肩胛骨作为原料,通过酶解法制备抗氧化肽。本研究采用单因素试验,筛选酶解制备猪肩胛骨抗氧化肽的最佳单因素水平,并利用响应面分析法对猪肩胛骨抗氧化肽的酶解工艺参数进行优化。同时,运用4种体外抗氧化法评价猪肩胛骨抗氧化肽粗提物的抗氧化活性。在此基础上,运用超滤技术、凝胶层析法、反相高效液相色谱（RP-HPLC）对猪肩胛骨抗氧化肽进行分离纯化,并通过液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）对所制备的猪肩胛骨抗氧化肽进行鉴定。以1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH）自由基清除率、多肽得率作为评价指标,分析比较6种不同蛋白酶对脱脂猪肩胛骨骨粉的酶解效果,筛选出风味蛋白酶为最佳酶。利用风味酶对猪肩胛骨粉进行酶解,探究酶底比、底物浓度、酶解温度、pH值以及酶解时间对其效果的影响。在单因素试验的基础上进行响应面分析,通过建立二次多项回归模型发现,当酶解温度控制在55℃,pH值为6.0,酶底比6200 U/g、底物浓度3%,酶解时间4 h时,模型拟合度较好,所得工艺参数最优。此时,酶解液DPPH自由基清除率为75.90%,多肽得率为62.80%。以VC作阳性对照,利用4种体外抗氧化活性法对猪肩胛骨酶解液进行活性分析。猪肩胛骨酶解液对DPPH的半抑制浓度(IC50)值为4.59 mg/mL,对·OH的IC50值为2.363 mg/mL,对·O2-的IC50值是13.031 mg/mL。在浓度为10 mg/mL时,Fe2+还原能力的A700值为0.3526,为相同浓度时VC还原能力的15.11%。结果表明猪肩胛骨酶解液具有良好的抗氧化活性。对猪肩胛骨酶解液分别采用0.45μm、0.22μm滤膜过滤后,再通过10 kDa、5 kDa的超滤离心管对滤液进行截留,分析滤液的色值、澄清度、蛋白得率及DPPH自由基清除能力。研究显示,两种滤膜所得滤液的性质差别不显著（p>0.05）,综合考虑采用0.45μm滤膜对猪肩胛骨酶解液进行过滤;截留分子量<5 kDa时,抗氧化活性最强,选用<5 kD的组分进行下一步分离纯化。以不同的洗脱液、洗脱流速、上样量为变量,比较Sephadex G-25凝胶层析对分子量<5 kD的组分的分离效果。研究发现:以超纯水为洗脱液,流速0.3 mL/min,上样量为1 mL时,分离效果最佳,得到3个组分A、B、C,其中组分C的抗氧化活性最强,IC50值为0.6528 mg/mL。利用Sephadex G-15凝胶层析法对组分C进一步分离,考察不同的洗脱液、洗脱流速、上样量对分离纯化效果的影响。研究表明,以超纯水为洗脱液,流速0.15 mL/min,上样量为3 mL,分离效果最佳,得到4个组分C1、C2、C3、C4,其中组分C2抗氧化活性最高,IC50值为0.1797 mg/mL。利用RP-HPLC对组分C2进一步分离纯化,通过改变流动相配比、流速、柱温3个参数对RP-HPLC分离猪肩胛骨抗氧化肽的条件进行优化。结果表明:流动相A为超纯水（含0.05%TFA）,流动相B为乙腈（含0.05%TFA）,柱温25℃时,A:B=95:5（V:V）,洗脱流速0.75 mL/min,分离效果最佳,得到3个组分C21、C22、C23,其抗氧化活性最高的组分C23的IC50值达到0.0710 mg/mL。采用nano HPLC在线连接电喷雾飞行时间串联质谱（ESI-TOF-MS/MS）对组分C23进行鉴定,测定其相对分子质量为700.4 Da,氨基酸序列为ARGPDGG。本研究旨在合理利用废弃猪肩胛骨,提高猪肩胛骨的附加值,促进猪骨产业的多方面发展。同时,本研究提供了一种制备抗氧化肽的低廉原料,为功能性食品的开发奠定基础,具有非常重要的现实意义。