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目的:
通过对原代培养的大鼠血管平滑肌细胞中转染针对早期生长反应因子-1(early growth response factor-1,Egr-1)的诱骗寡核苷酸(decoyoligodeoxynucleotide,decoy ODN),检测转染前后血管平滑肌细胞(vascular smoothmuscle cell,VSMC)中Egr-1和富含半胱氨酸蛋白61(cysteine-rich61,CCN1/CYR61)的表达变化并测量VSMC迁移情况,探讨针对Egr-1的decoy ODN对体外培养的大鼠平滑肌细胞迁移的影响和作用机制。
方法:
取大鼠胸主动脉中膜,通过组织块贴壁法进行原代大鼠动脉VSMC培养,传代培养和鉴定,设计合成针对Egr-1的decoy ODN及诱骗对照寡核苷酸。细胞爬片后应用人工合成的Egr-1 decoy ODN进行细胞转染。将实验分为对照组(正常培养细胞)、诱骗组(Egr-1 decoy ODN转染组)、诱骗对照组(杂码寡脱氧核苷酸转染组,Egr-1 decoy ODN SCR)。采用RT-PCR法检测转染前后各组不同时间点(24h、48h、72h)Egr-1及CCN1 mRNA的表达情况,免疫组织化学法检测转染前后各组不同时间点(24h、48h、72h)的Egr-1及CCN1蛋白的表达变化,进行图像分析,并采用划痕法测定VSMC的迁移距离。所有数据均采用SPSS16.0统计软件进行统计分析,计量资料以均值士标准差((x)±s)表示,各组间比较应用单因素方差分析,P＜0.05有统计学意义。
结果:
成功进行原代VSMC培养,经细胞鉴定培养细胞为高纯度的VSMC。转染Egr-1decoy ODN及Egr-1 decoy ODN SCR,观察各组不同时间点Egr-1和CCN1 mRNA及蛋白表达情况。RT-PCR结果显示:Egr-1和CCN1 mRNA在对照组,诱骗组及诱骗对照组中均有表达。在不同时间点,诱骗组Egr-1和CCN1mRNA的表达均低于对照组,经统计学分析P＜0.05,有统计学意义。免疫组织化学法结果显示:Egr-1和CCN1蛋白在三组中均有表达。在不同时间点,诱骗组Egr-1和CCN1蛋白的表达均低于对照组,经统计学分析P＜0.05,有统计学意义。划痕实验结果显示:转染后48h,对照组、诱骗组及诱骗对照组VSMC迁移距离分别为105.23±7.81、58.65±12.68、106.47±7.601μm,诱骗组VSMC的迁移距离明显低于其它两组(P＜0.01)。
结论:
Egt-1是一种重要的核转录因子,可以促进VSMC的增殖、迁移。对体外培养的VSMC转染Egr-1 decoy ODN可在一定程度上抑制Egr-1和CCN1 mRNA及蛋白表达,从而抑制VSMC迁移,为再狭窄等血管增殖性疾病的治疗提供了新的靶点。