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目的：构建弓形虫昆山分离株和RH株速殖子期表达的基因的完整长度cDNA文库，从中筛选保护性抗原基因，导入乳酸乳球菌进行表达，制备弓形虫口服基因疫苗，免疫小鼠，观察其抗攻击感染的保护力。方法：用CF-11纤维素柱快速提纯速殖子，以盐酸异硫氰酸胍（AGPC）一步法抽提总RNA，oligo-dT纤维素分离mRNA后，用ClonTech公司的SmartTMPCR cDNA文库构建试剂盒，构建了弓形虫昆山分离株和RH株的表达型文库。采用聚合酶链反应（PCR）从cDNA文库中扩增得到编码P30和ROP1的基因，经DNA序列分析后导入表达载体pGEX-5x-3，然后在大肠杆菌BL21中进行表达。用亲和层析柱纯化表达产物，并以SDS-PAGE和Western blotting进行鉴定。从构建好的质粒psk-P30中以BamHI和XhoⅠ双酶切出P30基因，以相同的酶切位点导入psk-PsT质粒，再以PvuⅡ将Ps-P30-T切出，以相同的酶切位点导入大肠杆菌-等酸乳球菌穿梭表达质粒L2-PTRK而构建成L2-PsP30T质粒。用BamHI和XhoⅠ从构建好的psk-ROP1中切出ROP1再以相同的酶切位点导入L2-PsP30T而构建成L2-PsROP1T。电转化感受态乳酸乳球菌，以Western blotting分别鉴定P30和ROP1在乳酸乳球菌中的表达。大量发酵制备口服疫苗，并且通过口服方法免疫BALB/c小鼠。经过4周7次口服后，用约100个弓形虫RH株速殖子攻击感染已经口服法免疫的BALB/c小鼠，观察其抗攻击感染的保护力，并检测细胞因子IL-4、INF-γ水平的动态变化。结果：1.构建成弓形虫昆山分离株和国际标准株RH株cDNA文库，分别获得5×106（昆山分离株）和5×105（RH株）个独立克隆，重组率均为99％，插入片段的平均长度均约为1kb。2.获得弓形虫昆山分离株的P30基因和RH株的ROP1基因，并证明昆山分离株的P30基因与RH株的P30基因之间只有两个碱基不同。我们得到的RH株的ROP1基因在Ossorio报道的基因的447位与448位之间有一96bp的插入片段，另有14个碱基不同，造成3个氨基酸的改变。两基因之间有91.19％的同源性。3.在大肠杆菌 乳臣扎球苗表达口用弓形虫基因疫苗的研究 中文摘要 表达P30基因时得到一分子量为54ica的融合蛋白，占大肠杆菌总蛋白 的38％。在大肠杆菌表达MI基因时得到一分子量约为7IkDa的融 合蛋白。4．P3 0 ＄因和ROPI基因在乳酸乳球菌中的表达产物中分别有一 约30ica、43 ica的蛋白带能被弓形虫病人血清识别 5．P30组其平均 寿命为 14．25天，ROPI组其平均寿命 7．75天，P30加 ROPI组其平均寿 命7．5天，空质粒对照组为8．5天，生理盐水对照组为8天。与对照组 相比，免疫组的eF4的水平升高，而h4的水平降低。结论：l本文库 可望用于弓形虫疫苗研究的候选基因的筛选。2．得了一与OSS。i。报道的 基因有较大差异的ROP基因。3分别在大肠杆菌中得到了P30融合蛋 白和ROPI融合蛋白的高效表达。4．在乳酸乳球菌中得到了P30蛋白和 ROP蛋白的微量表达。5．通过口服法进行乳酸乳球菌活菌表达的弓形虫 基因疫苗免疫是一种有希望的抵抗弓形虫的方法。