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目的:探讨瑞香素(E003)联合Bcl-2-siRNA和sFas-siRNA对CIA大鼠滑膜细胞抑凋亡基因的作用及分子机制，进一步探索瑞香素联合小干扰RNA治疗RA的可能机制，为瑞香素的药用开发和RA的治疗思路提供理论与实验依据。方法:1.设计并采用化学合成法合成抑凋亡基因Bcl-2、sFas干扰片段各3条；2.筛选最佳siRNA：实验分组：①Bcl-2-siRNA第1条片段处理组(si-Bcl-2.1组)；②Bcl-2-siRNA第2条片段处理组(si-Bcl-2.2组)；③Bcl-2-siRNA第3条片段处理组(si-Bcl-2.3组)；④sFas-siRNA第1条片段处理组(si-sFas.1组)；⑤sFas-siRNA第2条片段处理组(si-sFas.2组)；⑥sFas-siRNA第3条片段处理组(si-sFas.3组)；⑦阴性对照组(NC组)；⑧阴性荧光对照组(NC-Cy3组)；⑨健康对照组(health组)。采用脂质体法将上述片段转染CIA大鼠滑膜细胞(siRNA终浓度为100nM)，NC-Cy3组经常规培养24h和48h后，分别在倒置显微镜下观察红色荧光，确定转染是否成功。其他组48h后收集细胞，实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR，RT-PCR)检测抑凋亡基因Bcl-2及sFas mRNA表达。3.优化siRNA的作用：取最佳si-Bcl-2和si-sFas片段，浓度（nM）为：10、20、30、50、100、200分别作用于CIA大鼠滑膜细胞24h、48h、72h后,实时荧光定量RT-PCR检测抑凋亡基因Bcl-2及sFas mRNA表达。4.优化瑞香素的作用：瑞香素(40μg/mL)分别作用CIA大鼠滑膜细胞24h、48h、72h后，实时荧光定量RT-PCR检测抑凋亡基因Bcl-2及sFas mRNA表达。5.瑞香素联合Bcl-2-siRNA和sFas-siRNA对CIA鼠滑膜细胞抑凋亡基因作用及分子机制：实验分组：①健康Wister大鼠滑膜细胞对照组(health组)；②CIA大鼠滑膜细胞对照组(CIA组)；③瑞香素(40μg/mL)处理组(E003组)；④Bcl-2-siRNA处理组(si-Bcl-2组)；⑤sFas-siRNA处理组(si-sFas组)；⑥Bcl-2-siRNA联合sFas-siRNA处理组(si-B-F组)；⑦瑞香素(40μg/mL)联合Bcl-2-siRNA处理组(E003-B组)；⑧瑞香素(40μg/mL)联合sFas-siRNA处理组(E003-F组)；⑨瑞香素(40μg/mL)联合Bcl-2-siRNA和sFas-siRNA处理组(E003-B-F组)。按上述实验分组，脂质体法转染CIA大鼠滑膜细胞，检测如下指标：(1)实时荧光定量RT-PCR检测CIA大鼠滑膜细胞抑凋亡基因Bcl-2、sFas及凋亡信号的通路蛋白STAT3、caspase8mRNA表达；(2)流式细胞术检测抑凋亡基因Bcl-2及sFas蛋白表达；(3)Annexin V/PI双染流式法检测滑膜细胞的凋亡率。结果:1.最佳siRNA的筛选结果：si-Bcl-2.1组（0.960±0.030）mRNA的相对表达量明显低于si-Bcl-2.2组(1.352±0.023)、si-Bcl-2.3组(1.418±0.024)和NC组(1.428±0.061)(P<0.05); sFas.1组(0.829±0.015)的mRNA相对表达量显著低于sFas.2组(1.238±0.021)、sFas.3组(1.260±0.020)和NC组(1.276±0.030)(P<0.05)。2. siRNA.1的优化结果: si-Bcl-2.1和si-sFas.1在浓度为100nM作用CIA大鼠滑膜细胞48h后Bcl-2、sFas mRNA表达量分别为3.689±0.108、3.196±0.023，都明显低于相应的其他组,差异有统计学意义(P<0.05)。3.瑞香素的优化结果：瑞香素分别作用滑膜细胞48h和72h后，Bcl-2mRNA相对表达量都明显低于24h(P<0.05)；48h和72h比较，Bcl-2表达量无显著性差异(P>0.05)；瑞香素作用滑膜细胞48h和72h后，sFas mRNA相对表达量明显低于24h(P<0.05),且72h的sFas mRNA表达量明显低于48h，差异有统计学意义(P<0.05)。4.瑞香素联合si-Bcl-2、si-sFas对CIA大鼠滑膜细胞抑凋亡基因Bcl-2、sFas的作用及分子机制：⑴瑞香素联合si-Bcl-2、si-sFas对CIA大鼠滑膜细胞抑凋亡基因Bcl-2、sFasmRNA表达的影响：经瑞香素和siRNA单独/联合处理48h后Bcl-2、sFas mRNA表达水平均较CIA组均明显降低(P<0.05)；E003-B组或E003-F组和E003-B-F组Bcl-2、sFas mRNA表达量均明显低于E003组、si-Bcl-2组或si-sFas组、si-B-F组(P<0.05); E003-B或E003-F组与E003-B-F组之间无显著性差异(P>0.05)。⑵瑞香素联合si-Bcl-2、si-sFas对CIA大鼠滑膜细胞抑凋亡基因Bcl-2、sFas蛋白表达的影响：经瑞香素和siRNA单独/联合处理72h后Bcl-2、sFas蛋白表达水平较CIA组明显降低(P<0.05)；E003-B组或E003-F组和E003-B-F组Bcl-2、sFas蛋白表达水平均明显低于其他处理组(P<0.05)。E003-B组或E003-F组与E003-B-F组之间Bcl-2、sFas蛋白表达水平无显著性差异(P>0.05)。⑶瑞香素联合si-Bcl-2、si-sFas对CIA大鼠滑膜细胞凋亡率的影响：三者联合作用CIA大鼠滑膜细胞，其凋亡率明显高于其他各组(P<0.05)；单独E003处理组滑膜细胞的凋亡率明显高于si-Bcl-2组、si-sFas组、si-B-F组(P<0.05)，si-Bcl-2组滑膜细胞凋亡率明显高于si-sFas组(P<0.05)，但都低于E003-B和E003-F处理组(P<0.05)。⑷瑞香素联合si-Bcl-2、si-sFas对CIA大鼠滑膜细胞凋亡信号通路蛋白STAT3(线粒体途径)、caspase8(死亡受体途径)的影响：所有处理组STAT3mRNA表达量都明显低于CIA组(P<0.05)；E003-B组和E003-B-F组的STAT3mRNA表达量都明显低于E003组、si-bcl-2组、si-B-F组(P<0.05)。所有处理组caspase8mRNA表达量都明显高于CIA组(P<0.05); E003-F组和E003-B-F组的caspase8mRNA表达量都明显高于E003组、si-sFas组、si-B-F组(P<0.05)。结论：1.瑞香素、si-Bcl-2、si-sFas分别单独作用CIA大鼠滑膜细胞可下调抑凋亡基因Bcl-2和sFas mRNA及其相应蛋白表达水平。2.瑞香素可协同si-Bcl-2、si-sFas下调CIA大鼠滑膜细胞Bcl-2和sFas mRNA及其相应蛋白表达水平。3.瑞香素可协同si-Bcl-2、si-sFas促进CIA大鼠滑膜细胞凋亡。4.瑞香素联合si-Bcl-2、si-sFas对CIA大鼠滑膜细胞促凋亡作用的分子机制之一有可能是通过下调Bcl-2、sFas基因的表达水平，同时下调细胞凋亡线粒体途径中位于Bcl-2上游的通路蛋白STAT3和上调死亡受体途径中caspase8基因的表达水平，增强相应途径的信号转导，促进CIA大鼠滑膜细胞的凋亡。上述实验结果可望为RA的治疗思路以及瑞香素联合siRNA的药用开发提供理论与实验依据。