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除草剂作为三大农药之一,在农业生产中占据重要作用,但随着杂草抗性增加和环境保护法规的加强,除草剂发展面临巨大挑战。近二十年来几乎没有发现新的除草剂靶标,比较新的两种商品化除草剂作用模式,即生长素传输途径靶标和对羟基苯丙酮酸双氧酶(HPPD)。少量作用模式的除草剂长期重复使用,造成杂草抗性急剧发展。基于新靶标的除草剂研发是当前农药发展的迫切需要,也是解决杂草抗性问题和满足环境生态要求的有效途径。近年来研究发现生长素受体蛋白(TIR1)、4-香豆酸:辅酶A连接酶(4CL1)和4-二磷酸胞苷2-C-甲基-D赤藓糖醇合成酶(IspD)三种植物蛋白在植物生长代谢过程中具有重要作用,被确认为潜在除草剂靶标,因此研究这三种潜在除草剂靶标对开发新型除草剂具有重要意义。本论文基于基因组学和分子克隆技术对三种潜在除草剂靶标蛋白表达、纯化和活性测定进行研究,并为后续研究分子探针与靶标蛋白相互作用奠定了基础。主要工作内容如下:1.概述了除草剂和除草剂作用靶标的研究进展,植物体三种潜在除草剂作用靶标TIR1、4CL1和IspD的研究概况,靶标蛋白研究常用的方法及原核表达获得重组异源蛋白的应用。2.采用聚合酶链式反应(PCR)从拟南芥cDNA克隆获得生长素受体蛋白TIR1目的基因,构建了多种重组表达载体,而改造后的双标签pGEX-4T-1-TIR1(密码子优化)重组质粒,并进行蛋白的表达和纯化并通过免疫印迹分析验证。3.采用相同的方法从拟南芥的cDNA中PCR扩增获得4CL1酶目的基因,构建了重组质粒pCold I-4CL1,蛋白表达鉴定及亲和层析法纯化,获得重组蛋白酶,采用紫外分光光度法检测确定重组蛋白酶具有生物活性,这为后续筛选以该蛋白酶为靶标的抑制剂奠定基础;4.利用相同的方法从拟南芥的cDNA中PCR获得IspD目的基因,构建了两种重组表达质粒pCold I-IspD和pCold I-IspD(76-302),转化至宿主菌,进行蛋白的表达鉴定。其中pCold I-IspD为包涵体需要通过变性和复性后可获得蛋白;pCold I-IspD(76-302)蛋白表达为可溶性表达。通过亲和层析纯化获得了纯度和浓度较高的蛋白酶,分别用高效液相色谱法和分光光度法检测蛋白活性,并建立了用孔雀石绿和钼酸铵检测磷酸的高通量筛选抑制剂的方法,为筛选抑制剂和研究光亲和分子探针与靶标蛋白之间的相互作用奠定了基础。