脂筏(Lipid raft)位于细胞膜上,且含有丰富的胆固醇、磷脂和靶蛋白,它是一种在低温下不溶于非离子去垢剂的微区结构。脂筏的成分和人类的疾病密切相关,参与信号转导和蛋白的转运,从而与肿瘤、糖尿病和老年痴呆症等疾病有关。脂筏色谱是基于亲和色谱和细胞膜色谱法原理,通过生物分子的特异亲和吸附,可同时对活性成分进行筛选、分离富集及结构的鉴定。目前构建的有单靶点和多靶点脂筏色谱,初步证明可以高效率高选择性地从复杂的中药中筛选出活性成分,过程快速简单,具有高度专一性,改善了传统中药提取时复杂耗时的情况,同时也延长了部分亲和色谱和细胞膜色谱的使用时间;但至今未有系统的制备和评价方法,仍然存在重复性差的问题。P-糖蛋白(P-gp)具有能把药物泵出细胞外的功能,成为肿瘤药耐药、药物生物利用度低的原因之一。越来越多的研究者投入到P-gp底物和抑制剂的体外筛选研究中。目前关于脂筏功能和亲和色谱的报道较多,但对于脂筏提取和表征方法的优化及脂筏成分含量的测定研究较少,对脂筏色谱的构建及吸附性能研究便少之又少。本文选取常用的去垢剂法和非去垢剂法从细胞中提取脂筏,分析比较不同提取方法对Caco-2细胞和U251细胞中脂筏成分的影响;对脂筏中的胆固醇和总蛋白进行了定量方法研究,以期使脂筏的研究走向定量化,可控化;构建富含Pgp蛋白的脂筏色谱,对脂筏固定相进行表征分析,并研究脂筏成分的含量与脂筏柱吸附性能的关系,考察脂筏色谱的吸附性能及其影响因素。为解决重复性差的问题提供借鉴和思考;同时为体外筛选与P-gp相互作用的成分提供依据;为活性成分的高效筛选和各类疾病新靶标的发现提供新的思路。第一章综述本章主要介绍了研究对象脂筏及脂筏色谱。首先对脂筏的定义、结构、功能及提取与表征的方法进行了归纳概括,为脂筏提取与表征的优化提供借鉴;同时对脂筏的成分研究进行了阐述,介绍了脂筏成分胆固醇、总蛋白、特征蛋白等的功能和作用,以及它们量化的方法;接着,又介绍了P-gp的生理功能及其底物和抑制剂体外筛选的方法;最后介绍了亲和色谱和脂筏色谱的原理和应用,以及亲和色谱机制及吸附性能的影响因素,以期为脂筏色谱的广泛应用提供借鉴和思考。第二章脂筏提取与鉴定本章进行了Caco-2细胞和U251细胞的培养,采用不同方法提取脂筏并进行表征比较。通过去垢剂法1、去垢剂法2和非去垢剂法裂解Caco-2细胞和U251细胞,后采用蔗糖密度梯度离心法提取和收集脂筏。并以加入β-环糊精为阴性对照组,采用Western Blot、免疫荧光的方法对脂筏进行了表征。通过Western Blot法对脂筏特征蛋白caveolin-1和Flotillin-1,细胞的特征蛋白P-gp和Trka的表征确定了脂筏的层数,分析了不同方法对脂筏提取产生的影响。结果显示,不同方法提取脂筏的分层和脂筏中的蛋白表达情况不同:去垢剂法比非去垢剂法提取的脂筏量多且提取更充分,而去垢剂法2比去垢剂法1提取效果更好,脂筏层更多,目标蛋白P-gp表达更高。因此应根据实验需要及细胞特性,选择合适的提取方法。这为后续研究脂筏成分和构建脂筏色谱奠定了基础。第三章脂筏成分定量本章对不同方法提取的Caco-2细胞脂筏各层中总蛋白和两种细胞脂筏中的胆固醇进行了定量方法研究。总蛋白采用BCA(去垢剂兼容型)试剂盒法测定;胆固醇采用了高效液相和试剂盒的方法进行了定量方法研究。由蛋白含量可以看出:去垢剂法提取的脂筏蛋白总量比非去垢剂法多,被破坏脂筏结构的β-环糊精对照组蛋白含量最低;脂筏各层总蛋白含量与该层Flotillin-1和P-gp的表达规律呈现一致性。这不仅为脂筏提取条件的优化提供了量化的补充说明,同样也为探讨脂筏中蛋白含量分析提供了新的数据。胆固醇含量结果表明,高效液相法的样品前处理过程复杂易导致样品损失,使杂质峰多而样品峰小难以分辨;且初步发现U251细胞提取的脂筏中胆固醇含量略高于Caco-2细胞提取的脂筏中胆固醇含量。对脂筏成分的定量,以期使脂筏的研究走向量化和可控化,为脂筏成分的定量研究提供经验和参考。第四章脂筏色谱固定相制备及表征方法研究对脂筏与硅胶结合的方法和表征方法进行了探讨研究。采用课题组之前的静态吸附法结合,并摸索使用碳纳米管对硅胶进行改造的方法。采用免疫荧光、扫描电镜、能谱分析方法对固定相进行表征,对扫描电镜中制样的方法进行了详细的比较研究。同时,优化了固定相硅胶的种类及脂筏与硅胶结合的最佳比例。本章旨在制备和优化脂筏色谱固定相,为促进脂筏色谱更好的应用提供前提条件。第五章脂筏色谱构建及吸附性能评价本章构建了富含P-糖蛋白的Caco-2细胞脂筏色谱模型,以维拉帕米为阳性药物进行了脂筏色谱的吸附性能评价。研究脂筏成分的含量与脂筏柱吸附性能的关系,确定了脂筏与硅胶结合的比例,同时考察了脂筏色谱的专属性、稳定性和使用时限。对影响脂筏色谱吸附性能的因素进行了考察,对流动相的组成,流速,温度等进行了进一步研究。确定了用去垢剂法2提取的脂筏,本文制备条件下,脂筏与硅胶结合的比例为1:1较好,进行装柱制备富含P-gp蛋白的脂筏色谱模型效果更好,且本法制备的脂筏色谱柱具有良好的专属性、3个月内吸附性能稳定,连续使用200个小时后依旧保持良好的吸附性能。最终确定了色谱条件为:流动相为10 mmol/L的乙酸铵(PH7.2-7.4)、流速为0.3 mL/min、温度为37℃。