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目的:观察模拟缺血再灌注对肾小管上皮细胞凋亡的影响;观察RhoA和GTP-RhoA在模拟缺血再灌注时的变化规律;观察RhoA的特异性抑制剂(C3转移酶)对GTP-RhoA和细胞凋亡的影响:研究RhoA在模拟缺血再灌注诱导人肾小管上皮细胞凋亡中的作用。
方法:体外培养人肾小管上皮细胞(HK-2细胞),建立模拟缺血再灌注模型。HK-2细胞共分为四组:正常对照组(C组)、单纯模拟缺血组(Ⅰ组)、模拟缺血再灌注组(I/R组)、C3转移酶预处理组(C3组),其中C3转移酶预处理组又分为低剂量组(C3L,0.02μg/ml)、中剂量组(C3M,0.20μg/ml)和高剂量组(C3H,2.00μg/ml)。Hoechst 33258染色法观察模拟缺血再灌注时HK-2细胞凋亡的形态改变;流式细胞仪检测模拟缺血再灌注时HK-2细胞的凋亡率;Westernblotting法检测模拟缺血再灌注时RhoA的表达;GST RBD亲和沉淀法检测模拟缺血再灌注时GTP-RhoA的水平。
结果:正常HK-2细胞少量表达RhoA,在模拟缺血1h至再灌注24h过程中,RhoA的表达基本不变。GTP-RhoA在复灌30min显著增加,然后随再灌注时间的延长逐渐下降,在复灌6h又达到高峰,此时GTP-RhoA的峰值高于复灌30min时的峰值。模拟缺血1h再灌注12h、24h、48h和72h时,用Hoechst 33258染色法均观察到凋亡细胞核的变化,用流式细胞仪检测发现上述I/R不同时间段HK-2细胞的凋亡率均增加,以再灌注48h组细胞的凋亡率最高。C3转移酶预处理组均能不同程度抑制复灌30min时GTP-RhoA的表达,并且降低复灌48h的细胞凋亡率,以C3转移酶高剂量组(2.00 μg/ml)效果最好。
结论:RhoA的激活参与模拟缺血再灌注诱导的细胞凋亡,抑制RhoA的激活可以减少肾小管上皮细胞的凋亡,减轻肾脏缺血再灌注损伤。