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鳗弧菌（Vibrio anguillarum），隶属于弧菌科（Vibrionaceae），是常见的水产动物病原菌，可感染多种海水、淡水或半咸水鱼类以及双壳类和甲壳类动物。鳗弧菌感染宿主引起高致死性的出血性败血症，严重危害着全球水产养殖业，造成巨大经济损失。鳗弧菌血清型复杂，目前已知的血清型共23种（O1~O23），其中O1、O2和少部分O3 血清型菌株为致病型，其余为环境株。流行病学调查显示，O1、O2、O3 血清型致病株均流行于我国海水养殖环境，严重危害着我国大菱鲆（Scophthalmus maximus）、牙鲆（Paralichthys olivaceus）、虹鳟（Oncorhynchusmykiss）等海水鱼类养殖业发展。随着鱼类免疫学研究的不断深入与疫苗免疫技术的不断发展，鱼用疫苗正逐渐取代抗生素成为水产动物疫病防治的主流手段。 1. 本实验在实验室摇瓶发酵培养条件下对鳗弧菌VAM003株生长条件进行了初步优化，采用单因素实验法对氯化钠浓度、氮源种类及氮源添加量、碳源种类及碳源添加量进行筛选。实验结果显示，培养基中氯化钠浓度应不低于1%；氮源中胰蛋白胨促生长作用最佳，当添加量为2%时菌产量达峰值；碳源中蔗糖促生长作用最佳，添加量为1.5%时菌产量达到峰值。 2. 本次实验在5 L发酵罐基础上，以含2.5%氯化钠的TSB培养基为发酵培养基，以鳗弧菌VAM003株为对象，研究了二级种子液培养时间、发酵培养基氯化钠浓度、二级种子液接种量、补料发酵，初步建立了发酵工艺：种子液按10%接种量接种到300 mL氯化钠浓度为2.5%的TSB培养基，28℃，180r/min恒温振荡培养12~14 h 得二级种子液；按 10%接种量将二级种子液接种到发酵罐，28℃，通气搅拌培养，发酵4 h后开始匀速添加补料葡萄糖，6 h后开始匀速添加补料10倍浓缩的TSB，发酵培养10~12h后收获菌液。随后在500 L发酵罐进行了放大培养，培养10h后菌液OD600值达最大值，此时菌液活菌数为12.0×109 CFU/mL。 3. 本实验对大菱鲆鳗弧菌灭活疫苗（VAM003 株）中试产品进行了免疫效力评价，检测了疫苗稳定性、保存期、安全性、最小免疫剂量、对不同规格大菱鲆免疫保护效果、对同O1血清型其他菌株及O2、O3血清型菌株的交叉保护作用。实验结果表明疫苗稳定性良好，不同生产批次疫苗免疫后28天RPS均达到100%，单剂量重复注射后也未有不良反应产生，最小免疫剂量为0.025 mL/ind，对体重50 g以上的大菱鲆均有免疫保护作用，疫苗在4℃条件下至少可贮存18个月。 4. 本课题在鳗弧菌二价（O1/O2）灭活疫苗的基础上以鳗弧菌 VAM003（O1）、VAM007（O2）、M2016261（O3）为抗原制备了抗原浓度为108 cells/mL及109 cells/mL的鳗弧菌三价疫苗，将大菱鲆随机分为2免疫组和1空白对照组，2免疫组以0.1mL/ind腹腔注射免疫大菱鲆即 107 cells/ind 组、108 cells/ind 组，对照组注射相同剂量灭菌PBS。一次免疫60天后同法对108 cells/ind组进行了一次加强免疫，并检测了一次免疫后150天内及同时期二次免疫大菱鲆对三种抗原的血清凝集效价和RPS。实验结果显示，一次免疫 3 天后可检测到 107 cells/ind 组和 108 cells/ind 组大菱鲆抗鳗弧菌VAM003（O1）、VAM007（O2）、M2016261（O3）抗体，14天后两免疫组（107 cells/ind、108 cells/ind组）VAM003、VAM007、M2016261抗体效价快速升高，28天后抗体效价均达到峰值1∶248.89~1∶320，显著高于空白组（P＜0.05）。28~60天107 cells/ind组VAM003、VAM007、M2016261抗体效价保持在1∶151.11~1∶320，28~150天108 cells/ind组VAM003、VAM007、M2016261抗体效价保持在1∶106.67~1∶320。二次免疫3天后可检测到二免组 VAM003、VAM007、M2016261 血清抗体效价均高于同期一免组， 14天后显著高于同期一免组（P＜0.05），随后抗体效价均开始下降，60~90天血清效价与同期一免组无显著差异（P＞0.05）。攻毒实验结果显示，免疫7天后，107 cells/ind组和108 cells/ind组三种抗原的 RPS在5.56~43.75%，14天后107 cells/ind组和108 cells/ind 组三种抗原的 RPS 均快速升高，28 天后均达到最大值 100%，60 天后 107 cells/ind组VAM003下降至71.43%，其余均保持在70%及以上，108 cells/ind 组RPS均保持在90%以上。120天后108 cells/ind组VAM003 RPS开始下降，150天后VAM003 RPS下降到35%，VAM003下降到65%，而M2016261还保持在较高水平100%。二次免疫30~60天三种抗原RPS保持在80%以上，均不低于同时期一次免疫组，90天后VAM003 RPS下降到75%，VAM007、M2016261仍保持在80%以上。综上所述，高剂量三价疫苗（109 cells/mL）抗体持续期为免疫后28~150天，若取RPS＞70%为有效免疫保护率，一次免疫后能为大菱鲆提供至少120天的免疫保护期，二次免疫后免疫保护期延长至150天。低剂量疫苗（108 cells/mL），抗体持续期及免疫保护期至少为60天。