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在过去的二十多年里,纳米孔技术作为单分子检测技术的重要一员,因其免标记、免放大、高灵敏度、实时识别等诸多优点而备受关注。生物纳米孔是最早被发现和使用的纳米孔,由于具有原子精确的结构重现性、易于大量制备以及同许多生物学上重要分析物分子尺度相似的孔径等优势而受到研究者的广泛青睐。1996 年,Kasianowicz 等人率先使用天然的 α-溶血素（alpha-hemolysin,α-HL）生物纳米孔表征了单个寡核苷酸链,开启了纳米孔单分子检测道路。常见的生物纳米孔的本质是蛋白质,这使得我们很容易对其进行工程改造,如定点突变或引入特定适配器,进而对生物纳米孔作出定义明确的局部改变,使孔道能更好地实现某种特定应用。基于天然的或者工程改造后的生物纳米孔,研究人员已经实现了对与孔道孔径尺寸匹配的如金属离子、核酸、蛋白质等重要分析物的单分子测量。尽管已经取得了许多瞩目的研究成果,基于纳米孔这种独特限域空间内的单分子分析仍存在一些问题,例如纳米孔内的离子传感研究还停留在离子的检测上,尚不清楚纳米孔内离子传感的整体规律是什么;基于纳米孔的核酸研究中分析物过孔的速度往往很快,需要开发简单可行的方法来减慢核酸的过孔以得到更多的测量信息;纳米孔DNA测序研究中存在无效测序时间长,检测通量有待提高等。针对以上提到的这些问题,本论文展开了如下研究:在纳米孔限域空间内研究了单分子水平上的离子传感规律;开发了一种简便通用的核酸减速过孔策略;以及针对DNA测序效率低的问题提出了一种新的测量方案。主要研究内容包括以下三个部分:1.工程化MspA孔内的单分子软硬酸碱相互作用早期的生物纳米孔离子传感研究大多在α-HL纳米孔中进行的,由于离子尺寸小,产生的阻孔信号一般很小（1～3 pA）。耻垢分枝杆菌孔蛋白A（Mycobacterium smegmatis porinA,MspA）纳米孔为宽前庭、窄收口的锥形结构,在纳米孔测序方面的优异表现已证明它比α-HL具有更高的灵敏度和空间分辨率,只是该孔道在核酸之外的研究工作甚少。2019年,我们课题组首次使用MspA纳米孔测定了 HAuCl4,观测到了超大的单离子传感信号,表明MspA纳米孔是非常合适的离子传感纳米反应器。然而,纳米孔中的离子传感工作目前还停留在离子的检测上,尚且不清楚纳米孔限域空间内单分子水平上的离子传感规律。对此,我们工程改造了 MspA纳米孔最灵敏的91号位点为不同的氨基酸,在纳米孔限域空间内构建了功能性传感界面,研究了单分子水平上三种代表性氨基酸（天冬氨酸、组氨酸和半胱氨酸）与多种二价金属离子的配位作用。通过比较配位动力学参数,我们发现纳米孔限域空间内的离子传感规律整体符合软硬酸碱（hard-soft-acid-base,HSAB）理论,即“软亲软,硬亲硬”。此外,通过微调pH我们可以调控离子与氨基酸的配位作用。以上研究结果表明MspA纳米孔非常适合探测各种极小分析物,如单原子和多原子离子、小分子和化学反应中间体,而纳米孔限域空间内单分子水平上的软硬酸碱规律的揭示将有助于后续孔道内的离子传感设计。2.钙离子流调控生物纳米孔内的核酸传感生物纳米孔内的核酸传感是研究得最多的一个领域,然而核酸的过孔速度通常很快,一般得到的是毛刺信号,大量的过孔细节难以被观测到,因此往往需要一些手段来减慢核酸的过孔速度。常用的减慢核酸过孔的方法是构建双链DNA,利用双链过孔时的链解开来减慢过孔速度进而得到特异性传感信号。这种方法前期的链构建过程复杂且不同序列的核酸需要设计不同的互补链,普适性较差。因此,我们还需开发更为简便且通用的方法来减慢核酸的过孔。受到光学纳米孔中核酸过孔速度变慢现象的启发,我们在电生理单通道记录中进行了系统性研究。我们发现是引入的钙离子流在核酸过孔减速中起到了重要作用,主要原因可能是钙离子与核酸骨架之间强的相互作用。通过在测量槽的两侧不对称的放置KCl/CaCl2缓冲,核酸（DNA/RNA）的过孔速度被减慢并且捕获效率得到了提高。最后,利用减速效应,我们实现了三种RNA均聚物的直接区分。这种仅需改变测量缓冲液的减速手段原则上适用于各种纳米孔和核酸分析物。也就是说,我们提出的减速策略是通用的,同时简单易操作。3.即刻响应的纳米孔DNA测序2012年,JensH.Gundlach组利用突变的MspA纳米孔,结合phi29 DNA聚合酶的减速作用最终实现了纳米孔DNA测序。然而,在实际的测序过程中由于待测样品是随机获取的,超过90%时间用来等待样品进孔并且之后得到的绝大部分是文库的过孔信号而非测序信号,因此浪费了宝贵的样品和测量时间;同时,基于离子电流的信号采集模式由于电路集成难度高导致检测通量有限。荧光纳米孔技术具有检测通量高的优势,可有效解决DNA测序在电信号采集模式下通量低的问题,但是它的背景荧光使其有效检测时间仅约为15 min。如果能实现施加电压即刻响应的纳米孔DNA测序,结合荧光纳米孔技术的高通量就可以在检测时间和检测通量上提升纳米孔测序性能。基于此目的,我们开发了一种新的DNA测序策略,即首先将DNA文库中的一条核酸链偶联到MspA纳米孔入口处,然后在孔口构建测序文库,达到施加电压即有文库过孔的效果。结合phi29DNA聚合酶的减速作用后,我们最终实现了施加电压即刻产生测序信号的设想。