第一部分CCR2敲除对小鼠糖尿病心肌病的影响目的糖尿病是一组由多病因引起的以慢性高血糖为特征的终身性代谢性疾病。心脏是糖尿病最常见的受累器官之一。糖尿病患者发生心力衰竭的比例显著高于非糖尿病患者。越来越多的研究表明,趋化因子受体广泛参与的机体的各种疾病的病理生理过程,然而他们在糖尿病心肌病中的作用以及机制的研究目前还甚少。本实验的研究目的就是探究趋化因子受体2(CCR2)在糖尿病心肌病中的表达以及其对糖尿病心肌病心功能的影响。方法将8-10周龄的野生型小鼠和CCR2基因敲除小鼠分别随机分为两组组,一组C57和一组CCR2敲除小鼠给予柠檬酸缓冲液注射的为对照组,另外两组给予STZ注射的为糖尿病组。四组小鼠喂养六个月,连续记录体重和随机血糖。利用小动物超声技术和血流动力学检测小鼠心功能。用实时定量、免疫印迹和免疫组化的方法研究CCR2在糖尿病心肌病的心脏中的表达变化。小鼠处死后,自动生化仪分析小鼠血清中总胆固醇和甘油三酯;HE染色观察心肌组织形态,WGA染色探究心肌细胞大小,Masson染色评估心肌内胶原含量。结果 CCR2在糖尿病心肌病中mRNA水平以及蛋白水平表达都增加。我们发现,CCR2敲除后,不会影响小鼠的血糖值,但是对糖尿病小鼠糖耐量都改善作用,对糖尿病引起的心体比的增加有降低作用;对血清总甘油三酯有下调作用,会增加糖尿病心肌病小鼠的生存率;不会改变心肌细胞的大小,但对心肌纤维断裂情况有所改善;会抑制糖尿病导致的心肌胶原沉积;会一定程度上阻止糖尿病心肌病导致的心功能的损伤。结论 CCR2在糖尿病心肌病心脏中表达上调,CCR2敲除会对糖尿病心肌结构和功能有一定的保护作用。第二部分CCR2在糖尿病心肌病中的作用机制研究目的通过前一部分的实验,我们明确了 CCR2敲除改善糖尿病心肌病的心功能障碍,接下来我们对其具体机制进行了进一步的探讨。方法利用实时定量、免疫印迹和免疫组化分析CCR2敲除对糖尿病心肌病心肌纤维化标志分子的表达影响。同时测量了氧化应激相关NADPH氧化酶的活性以及氧化应激标志分子的表达。另外,我们还利用TUNEL染色以及分析凋亡相关因子Bax/Bcl-2以及剪切的caspase-3的表达,研究CCR2敲除对糖尿病心肌病心肌凋亡的作用。而且还利用免疫荧光检测CCR2对巨噬细胞标记分子F4/80在糖尿病心肌中的表达变化;利用流式细胞术和实时定量分析CCR2敲除对糖尿病心肌中巨噬细胞的数量的影响以及对M1型和M2型巨噬细胞极化的影响。最后我们在单核细胞系中研究了CCR2的上游调控转录因子以及具体结合位点。结果CCR2敲除能抑制糖尿病心肌病心肌纤维化;同时通过抑制NADPH氧化酶的活性、4-HNE、3-NT含量来减少心肌氧化应激;CCR2敲除能减少F4/80的表达,减少糖尿病心肌中巨噬细胞的数量,同时能使心肌中巨噬细胞向M2型极化;另外我们发现CCR2上游调控的转录因子Nkx2.5,它能直接结合在CCR2的启动子上,CCR2在高糖THP1细胞中的表达是受Nkx2.5调控的。结论CCR2敲除小鼠糖尿病心肌功能的改善可能是通过抑制心肌纤维化、氧化应激和一定程度上阻止炎症细胞的募集实现的,并且CCR2在这个过程中可能是受转录因子Nkx2.5调控的。第三部分CCR2在糖尿病患者外周血单核细胞中的表达研究目的探讨CCR2在糖尿病患者外周血单核细胞中的表达方法收集141例糖尿病患者和20例门诊健康体检者,应用流式细胞术检测血清中CCR2在单核细胞中的表达水平。结果健康对照组CCR2在单核细胞表面的表达百分比为57.5±9.9,CCR2在HbA1C<8%的糖尿病患者外周血单核细胞的表达为62.1±14.6,与对照组无显著差异,CCR2在HbA1C>8%的糖尿病患者外周血单核细胞的表达为87.1±12.3,与对照组相比,差异极其显著(P<0.01)。结论糖尿病患者静脉血分离的单核细胞表面CCR2的表达明显高于健康对照组。