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肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7是一种重要的传染性病原菌。自1975年首次被分离以来,世界各地包括中国都有不同规模的暴发流行。EHEC O157:H7感染可致腹泻、出血性结肠炎(HC)、溶血性尿毒综合征(HUS)及血栓性血小板减少性紫癜(TTP)等疾病,严重者可导致死亡。EHEC O157的感染因具有暴发流行趋势、强烈的致病性与致死性和抗生素治疗可加剧病情的危险性等特点,已成为全球性公共卫生问题。目前对其感染仍缺乏有效的防治方法,研究证明抗生素可促使O157菌释放致死性志贺毒素(Stx)从而使患者并发HUS的危险性增加,因此进一步研究其致病机制以寻找新的有效的防治方法具有重要义。病原体和宿主的相互作用是决定感染及发病的关键。EHEC与宿主肠道粘膜上皮细胞的粘附是疾病发展的第一步。介导O157细菌粘附定植的主要结构单元是Ⅲ型分泌系统(TTSS)。该菌通过TTSS将其转位紧密粘附素受体(Tir)和Tir-细胞骨架偶联蛋白(TccP)等效应毒力分子转运至宿主细胞,经一系列的信号传导过程介导与宿主细胞的“粘附与擦拭”(A/E)损伤。TccP是最近发现并确定的一种新的O157:H7毒力因子,是O157转移至宿主细胞的效应分子中与宿主细胞分子N-Wiskott Aldrich综合症蛋白(N-WASP)相互作用的终端效应分子,由O157:H7基因组内编号为Z3072的开放阅读框序列编码,是一个富含脯氨酸的蛋白,为O157粘附宿主细胞、形成肌动蛋白踏板、造成A/E损伤所必需。本课题采用基因工程的方法对肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7 TccP蛋白进行了克隆表达、纯化,进而在此基础上制备了高滴度和高特异性的兔抗TccP多克隆抗体并对其应用进行了实验研究。首先选择EHEC O157:H7 Sakai菌株基因组为模板,采用PCR及序列测定等方法获得EHEC O157:H7 tccP DNA,克隆至原核表达载体pET-28a(+),转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达;对在C末端融合了6his纯化标签的表达产物进行Western blotting法分析;使用Ni2+-NTA离子换树脂进行蛋白纯化;纯化蛋白进行SDS-PAGE纯度分析。实验结果显示:成功构建了原核表达质粒pET-28a(+)-tccP;Western blotting结果表明,经IPTG诱导在大肠杆菌中表达了分子量为37kD左右的目的蛋白;表达产物经Ni2+-NTA离子交换树脂纯化,TccP-6his融合蛋白纯度为95%以上。以纯化TccP-6his融合蛋白免疫新西兰大白兔,成功制备了有较高滴度和特异性的兔抗TccP多克隆抗体。以所获特异性多克隆抗体作为一抗,使用双向免疫扩散、ELISA、Western blotting和免疫荧光等方法检测标本中TccP蛋白。结果显示:免疫扩散检测可见兔抗TccP多克隆抗体稀释度为1:32时,仍呈现明显沉淀线;ELISA检测结果抗体滴度为1:640 000;Western blotting检测表明:用兔抗TccP多克隆抗体与TccP抗原进行免疫印迹,在分子量约37kD处有一特异性条带,与阳性对照纯化TccP-6his融合蛋白相一致;细胞免疫荧光检测显示,在被O157细菌粘附的HeLa细胞部位可见绿色荧光,其分布与细菌粘附的部位一致。提示:所制备的兔抗TccP多克隆抗体与粘附至HeLa细胞的O157细菌发生抗原抗体反应,重组的TccP表现有与天然细菌分泌的TccP相同的免疫原性。在本课题实验研究中,我们从EHEC O157:H7 Sakai菌株的基因组中克隆得到了O157 tccP DNA序列,该序列与GenBank报道的序列完全一致;所构建的TccP原核表达载体在大肠杆菌中获得了高效表达,经纯化后得到了高纯度TccP-6his融合蛋白。以传统的多克隆抗体技术制备了兔抗TccP多克隆抗体。该多克隆抗体可用于对EHEC O157:H7中TccP蛋白进行特异性检测,适用于双向免疫扩散、ELISA、Western blotting和免疫荧光等多种常规检测方法。利用扫描电镜观察了O157体外粘附细胞模型,结果显示O157与HeLa细胞紧密粘附,呈典型的局灶性粘附(LA)。使用兔抗TccP多克隆抗体对EHEC O157:H7粘附宿主细胞模型内的TccP蛋白进行了亚细胞定位研究,结果直观地显示了TccP被聚集在宿主细胞被EHEC O157:H7粘附处细胞膜的下方。tccP基因的克隆表达、纯化,TccP蛋白的获得以及特异性兔抗TccP多克隆抗体的制备及应用成功,为后续进一步研究TccP在O157致病机制中的作用奠定了坚实的基础。目前国内未见类似研究报道,故本研究具有一定的创新性。此课题已获国家自然科学基金资助项目(30670107),后续相关研究正在进行中。