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第一部分Smad4蛋白在大肠癌组织中的表达及临床意义目的：探讨Smad4蛋白在大肠癌组织中的表达及其与患者临床、病理之间的关系。方法：利用免疫组化S-P法检测60例大肠癌组织、27例癌旁正常组织中Smad4的表达；回顾性收集相应患者的临床病理资料。结果：Smad4在大肠癌原发灶中的免疫组化切片评分,与癌旁正常组织相比,采用Mann-Whitney检验,U=294.50,有显著性差异(P<0.001)；Smad4的表达情况与肿瘤的浸润层次,淋巴结转移,Dukes分期有关(P<0.05)。结论：Smad4的低表达可能与大肠癌发生发展有关,Smad4可以作为大肠癌的预后指标和基因靶向治疗的有效靶点。第二部分Smad4表达下降对大肠癌细胞HCT116增殖性、迁移性、侵袭性以及BMP7-Smad4-Id2通路的影响(体外实验)目的：本部分实验研究HCT116细胞中的Smad4被小干扰RNA沉默后,是否影响了该细胞的增殖性、迁移性、侵袭性及细胞周期,是否影响了BMP7-Smad4-Id2信号通路的作用。方法：构建Smad4-shRNA质粒,并通过转染和筛选形成该质粒稳定转染的HCT116细胞。通过PCR, Western实验来验证Smad4-shRNA质粒的作用,并测量Id2的表达情况。通过MTT来评价细胞的增殖性的改变,通过Transwell实验来评价细胞迁移性和侵袭性的改变,通过流式细胞技术来评价细胞周期的改变。结果：成功构建Smad4-shRNA质粒,并形成该质粒稳定转染的HCT116细胞株。通过PCR和Western实验分别验证了Smad4在基因和蛋白水平的降低。同时,通过Western实验,得到干扰质粒对Smad4蛋白的抑制率为47.17%。干扰后的HCT116细胞,增殖性、迁移性和侵袭性均增强(P<0.05),细胞周期发生改变。干扰后的HCT116细胞中Id2的表达增加,但在该类细胞中BMP7增多不能引起Id2的改变。结论：在HCT116细胞中,Smad4的降低可以使细胞的增殖性、迁移性、侵袭性增加,Smad4是一种抑癌基因。BMP7通过Smad4改变Id2的表达来影响细胞的活性。BMP7-Smad4-Id2在大肠癌的发生发展中发挥作用。第三部分Smad4表达下降对大肠癌细胞HCT116裸鼠植瘤生长以及BMP7-Smad4-Id2通路的影响(体内实验)目的：研究Smad4表达降低的HCT116细胞在裸鼠皮下植瘤后肿瘤的生长情况以及BMP7细胞因子对各种细胞所植肿瘤的影响。方法：用HCT116细胞,HCT116-HK细胞,HCT116-Smad4-shRNA细胞构建裸鼠皮下成瘤模型,5天后肿瘤形成,将裸鼠分为(1)HCT116组：(2)HCT116-HK组：(3)HCT116+BMP7组：(4)HCT116-Smad4-shRNA组：和(5)HCT116-Smad4-shRNA+BMP7组。五个实验组,每个实验组每隔2天瘤周注射0.2ml100ng／ml的BMP7或生理盐水,重复4次。观察肿瘤的大小和重量。通过PCR和免疫组化,测量每组肿瘤中Smad4、Id2在基因和蛋白水平上的表达量。通过TUNEL实验,评估每组肿瘤细胞凋亡的情况。结果：5天后,裸鼠植瘤均成功,肿瘤5-7mm大小,HCT116-Smad4-shRNA组肿瘤生长明显快于HCT116组和HK组。PCR提示HCT116-Smad4-shRNA组肿瘤中Smad4mRNA表达降低,Id2mRNA表达增加。对于OT116-Smad4-shRNA组细胞所成肿瘤,有无BMP7作用,不影响Id2的表达和肿瘤的生长。TUNEL实验提示HCT116-Smad4-shRNA组肿瘤中细胞凋亡降低。结论：Smad4-shRNA可以在体内实验中抑制大肠肿瘤的生长。BMP7-Smad4-Id2细胞信号通路在大肠癌的发生发展中起作用。第四部分Smad4再表达对大肠癌细胞SW480增殖性、迁移性、侵袭性以及BMP7-Smad4-Id2通路的影响(体外实验)目的：研究Smad4再表达对大肠癌细胞SW480增殖性和侵袭性的影响；探索BMP7是通过BMP7-Smad4通路,还是直接对Id2起调节作用,从而使Id2发生改变而影响细胞的活性。方法：成功构建Smad4-cDNA质粒并形成该质粒稳定转染的SW480细胞。通过Western实验来验证Smad4的再表达,并测量Id2的蛋白表达情况。通过MTT来评价细胞的增殖性的改变,通过Transwell实验来评价细胞迁移性和侵袭性的改变,通过流式细胞技术来评价细胞周期的改变。结果：成功构建Smad4-cDNA质粒,并形成该质粒稳定转染的SW480细胞株。通过Western实验验证了Smad4在蛋白水平的再表达。再表达后的SW480细胞,增殖性、迁移性和侵袭性均减弱(P<0.05),细胞周期发生改变,静止期细胞增多。再表达后的SW480细胞中Id2的表达降低,而且在该类细胞中BMP7增多可以使该类细胞的活性增强且引起Id2的增加。结论：在SW480细胞中,Smad4的再表达可以使细胞的增殖性、迁移性、侵袭性降低,进一步证实Smad4是一种抑癌基因。BMP7通过Smad4改变Id2的表达来影响细胞的活性。BMP7-Smad4-Id2在大肠癌的发生发展中发挥作用。