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本实验以山定子叶片为实验材料,采用农杆菌介导法,研究了抗生素及转化过程中各因素对转化的影响,成功获得转化Mxirt1基因的山定子转基因植株,建立了山定子转化体系,为山定子性状的定向改良奠定基础。具体实验结果如下:
研究了羧苄青霉素(Carb)、头孢霉素(Cef)、卡那霉素(Kan)、潮霉素(Hyg)对山定子叶片愈伤组织和不定芽诱导的影响。结果表明,羧苄青霉素对山定子叶片再生有明显的抑制作用,浓度低于450mg/L,的头孢霉素对山定子叶片愈伤和不定芽诱导影响不大。极低浓度的潮霉素即可导致山定子叶片大面积褐化死亡,不适合做筛选抗性芽的抗生素。Kan浓度为40mg/L时,恰好可完全抑制不定芽再生而不使叶片死亡,可作为山定子叶片转化过程中合适的筛选压力浓度。
通过比较在卡那霉素筛选培养基上的抗性芽百分率,研究激素配比、乙酰丁香酮、脯氨酸、共培养时间、预培养时间、侵染时间、暗培养时间、培养基碳源及固化物对转化的影响。结果表明:预培养不利于山定子叶片的转化;菌液中添加乙酰丁香酮和脯氨酸对转化无明显影响;侵染10或15min,共培养3天,暗培养2或3周得到的抗性芽百分率最高;转化后叶片再生培养基的最适碳源为葡萄糖或蔗糖,最适固化物为植物凝胶和Gelrite,最佳激素配比为NAA1.0mg/L+BA2mg/L+TDZ4mg/L。抗性植株经PCR检测,初步证明外源目的基因已整合到山定子基因组中。