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纤维素酶是一种复合酶，根据各酶功能不同，可分为三类：内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶。纤维素酶是糖苷水解酶的一种，它可以将纤维素物质水解成单糖，进而发酵产生乙醇，从而解决农业、再生能源以及环境污染等问题。此外，纤维素酶在纺织、食品、饲料和制药行业等领域均具有广泛的应用。纤维素酶在实际应用中取得的成效与预期的目标相距甚远，主要是因为纤维素酶活性不高，因此提高纤维素酶的产量，降低生产成本成为当务之急。随着对纤维素酶研究的不断深入，生物化学、分子生物学以及基因工程等多种交叉学科的快速发展，获得适合工业化生产的高比活力的纤维素酶已指日可待。
为提高纤维素酶的产量，本论文根据毕赤酵母的偏爱密码子，在不改变内切葡聚糖酶氨基酸序列的前提下，利用分子生物学软件DNAstars、Rensselaer-Wadsworth Bioinformatics Center(BiC)(www. bioinfo. rpi. edu)生物学信息中心在线RNA折叠软件Mfold程序对内切葡聚糖酶基因的碱基含量、mRNA自由能△G、二级结构等生物学信息进行分析，将低频密码子替换为高频密码子，获得优化设计的基因。
本课题组从成功克隆的枯草芽孢杆菌C-36内切葡聚糖酶基因End(Genbank登录号：DQ782954)出发，对去掉信号肽的End基因进行生物学分析。分析表明该基因全长1413bp，编码470个氨基酸成熟肽。其中(G+C)％含量为44.70％，密码子第三位(G+C)％碱基含量为44.40％;加上巴斯德毕赤酵母α因子信号肽后(G+C)％为44.00％,密码子第三位(G+C)％碱基含量为42.00％。对End基因mRNA分析表明，折叠后最小自由能△G=-555.40kcal/mol。根据巴斯德毕赤酵母密码子偏爱性，去除内切葡聚糖酶基因中酵母表达低频密码子，替换为高频密码子，获得能在毕赤酵母中高效表达的内切葡聚糖酶优化基因Ends，长度为1413bp。改造后基因Ends与End的同源率为87.90％,(G+C)％为45.00％，密码子第三位(G+C)％碱基含量为50.50％。加上巴斯德毕赤酵母α因子信号肽后(G+C)％为44.30％，密码子第三位(G+C)％碱基含量为47.10％。对Ends基因mRNA分析表明，折叠后最小自由能△G=-548.90kcal/mol。
优化设计的End基因克隆及测序后，构建了优化内切葡聚糖酶的表达载体pPIC9K-Ends，获得含重组质粒pPIC9K-Ends的大肠杆菌DH5α。用含氨苄青霉素的液体培养基过夜培养阳性大肠杆菌DH5α，收集菌体，提取并纯化回收质粒pPIC9K-Ends。质粒pPIC9K-Ends经SalⅠ线性化后，电转化酵母GS115，经MM和MD平板筛选后，同时采用酵母总DNA的PCR鉴定和酶活测定的方法，筛选出阳性转化子，实现Ends基因在酵母中的分泌表达。工程菌pPIC9k-Ends-19在优化培养后，酶活达1034.7U，比未改造的阳性菌株(P. pastoris GS115 pPIC-End)提高了1.2倍，经G418抗性筛选，确定pPIC9k-Ends-19为单拷贝转化子。SDS-PAGE分析显示Ends基因与End基因产物的分子量都为79.82KD。经研究表明，优化后的基因Ends与未优化的基因End在毕赤巴斯德酵母中表达产物酶学性质一致。