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布鲁氏菌病(Brucellosis)是由布鲁氏菌(Brucella)引起的一种重要的人兽共患传染病,给畜牧业及人类健康造成严重危害。布鲁氏菌生物种型较多,感染宿主广泛,传统的分种方法主要是依据其表型特征和初始分离宿主而进行区分,而分子生物学方法是利用细菌特征性的遗传标志对其进行鉴别区分,且具有简单和快速的特点,结果判定也更为客观。本研究根据不同种布鲁氏菌靶基因上的单核苷酸多态性(SNP)位点,建立了能够快速鉴别七种主要布鲁氏菌的循环探针荧光定量PCR方法,可用于对不同种布鲁氏菌的鉴别诊断。同时,为了布鲁氏菌病的净化和控制提供有力的技术手段,本试验还建立了布鲁氏菌环介导等温扩增(LAMP)可视化检测方法,该方法设备条件要求低,结果易于判定,可用于基层兽医部门进行布鲁氏菌的快速检测。一、布鲁氏菌通用型循环探针荧光定量PCR检测方法的建立及应用根据布鲁氏菌BCSP31基因序列设计布鲁氏菌通用检测引物和探针,建立了布鲁氏菌循环探针荧光定量PCR检测方法。以构建的含BCSP31基因的质粒标准品10倍递进稀释为模板,检测所建立布鲁氏菌循环探针荧光定量PCR检测方法灵敏性,结果显示该方法能检测约10个拷贝的阳性质粒,且标准曲线的线性关系良好。以5株不同种的布鲁氏菌和猪大肠杆菌K99、巴氏杆菌C48-1、猪链球菌ST171、绿脓杆菌等4株对照菌检测该方法特异性,结果显示布鲁氏菌均出现典型的“S”型扩增曲线,CT值集中在17.29-20.77之间,其他对照菌40个循环内都无扩增曲线和CT值出现。用本方法和B4/B5-PCR方法对来自布鲁氏菌病流行地区三个不同牛场的40份血样、奶样和血清样进行平行检测。结果显示,本方法和B4/B5-PCR方法的结果符合率为80.0%。B4/B5-PCR检测为阳性的27份样品经本方法检测均为阳性；B4/B5-PCR检测为阴性的13份样本,经本方法检测,其中8份呈阳性,5份为阴性。本方法的灵敏性明显高于B4/B5-PCR方法。实验表明,所建立的循环探针荧光定量PCR方法具有灵敏、特异、稳定等特点,可用于布鲁氏菌感染的快速检测和流行病学调查等。二、循环探针荧光定量PCR方法用于布鲁氏菌分种的研究利用Whatmore等的多位点序列分析(MLST)结果,依据其不同种布鲁氏菌相应靶基因上SNP位点的差异,结合循环探针荧光定量PCR方法对布鲁氏菌进行分种鉴定。根据羊种布鲁氏菌(B. menlitensis)、牛种布鲁氏菌(B. abortus)、猪种布鲁氏菌(B. suis)、犬种布鲁氏菌(B. canis)、绵羊附睾种布鲁氏菌(B. ovis)、沙林鼠种布鲁氏菌(B. neotomae)和海洋哺乳动物种布鲁氏菌(B. mar is)不同靶基因上的SNP位点,分别设计种特异的循环探针,对羊种布鲁氏菌1、2、3型及疫苗株M5,牛种布鲁氏菌1、2、3、4、5、6、7、9型及疫苗株S19和104M,猪种布鲁氏菌1、2、3、4型及疫苗株S2,犬种布鲁氏菌和绵羊附睾种布鲁氏菌代表株的核酸DNA以及含有沙林鼠种布鲁氏菌PO基因片段和含有海洋哺乳动物种布鲁氏菌trpE基因片段的重组质粒进行验证,结果表明每种特异的探针可直接检测出某一特定种的布鲁氏菌(猪种布鲁氏菌除外),其它种布鲁氏菌和猪大肠杆菌K99等非布鲁氏菌不出现扩增信号,检测极限范围在10～100龟之间,相当于2.8-28个拷贝的布鲁氏菌基因组DNA。本研究建立的布鲁氏菌各个种循环探针荧光定量PCR方法具有较好的特异性和灵敏性,可以对布鲁氏菌在种的水平上进行区分。三、布鲁氏菌环介导等温扩增(LAMP)可视化快速检测方法的建立以omp25基因为靶序列建立了布鲁氏菌LAMP可视化检测方法。根据软件生成的各引物组的Tm值、末端稳定性、GC含量、引物之间的距离和二级结构等参数筛选出一套LAMP引物；提取布鲁氏菌的核酸作为试验模板,系统地对反应温度和体系中的主要试剂进行了优化,最终确定其最优反应条件为0.2μM F3/B3、1.2μMFIP/BIP、0.8μM LF/LB、10mMMgSO4、0.8M Betaine、1.5mM dNTPs和(?)UBst DNA polymerase,63℃反应60min。在优化好的反应体系中加入终浓度为120μM的羟基萘芬蓝(HNB),使反应结果可视化,发生LAMP扩增的反应管从紫色变为天蓝色；灵敏性试验结果表明该方法的检测极限为17fg的布鲁氏菌基因组DNA,与电泳结果相符。特异性试验结果显示只有布鲁氏菌反应管变为天蓝色,猪大肠杆菌K99、巴氏杆菌C48-1、猪链球菌ST171、绿脓杆菌等对照组均未出现扩增(仍为紫色)。用建立的LAMP可视化方法对布鲁氏菌病流行地区40份临床样本进行检测,并与B4/B5-PCR方法和循环探针荧光定量PCR方法平行检测结果进行比较。结果显示：B4/B5-PCR检测为阳性的27份样品经本方法检测有26份为阳性,B4/B5-PCR检测为阴性的13份样本,经本方法检测,其中5份呈阳性,8份为阴性,两者符合率为85.0%；循环探针荧光定量PCR检测为35份的阳性样品经本方法检测有31份为阳性,其它4份阳性样本经本方法检测为阴性,两者符合率为90.0%。